Способ выделения надокисной дисмутазы из белковых растворов

,.8011 х 14 А 61 К 37 4 ГОСУДАРСТВЕПО ДЕЛАМ ННЫЙ НОМИТЕТ СССЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ г АТЕН(72) Даек Таанинг Йохансен (1 Ж)(71) Де Форенеде Бриггерир А/С(56) 1. Рейегзеп К. ег, а 1.,Саг 1 зЬег 8Вез, Сопвпцп, 1977, 42, р, 391-395.2, Патент Дании У 131091,кл. А 61 К 37/02, 19753. З.А.Созсдп апй 1.ГгЫочдсЬ.ТЬе рпгИ 1 сагдоп апй ргорогйез ойзирегохЫе Йдзввеазе Егош ЗассЬагощусез сегеч 1 за 1. - Вдоем. ВорЬАсса, 1972, 289,. р. 276-283.(54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НАДОКИСНОИ ДИСИУТАЗЫ ИЗ БЕЛКОВЫХ РАСТВОРОВ, включакзций хроматографию ферментсодеркащего белкового раствора на катионообменной смоле, о т л и ч а ющ и й г я тем, что, с целью увеличения выхода и повыщеиия степени чистоты фермента, хроматографию ферментсодерзащего белкового раствора ведут при рН 4,7-5,0 на катионообменной смоле с той ке полярностью, что и надокисная дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы используют карбоксиметипцеллюлозу или декстраны, содержащие карбоксиметнльные или сульфопропильйые груп- Я пы, или агарозы, содержащие карбоксиметнльные группы.Изобретение относится к способуизвлечения содержащей медь и цинкнадокисной дисмутазы (НЕД) из водных растворов, содержащих указанныйэнзим совместно с сопутствующими 5протеинами,Надокисные дисмутазы представляют собой энзимы, каталитически воздействующие на дисмутацию надокисного радикала О, до кислорода и перекиси водорода20 +2 Н -НО, +О,Энзимы, обладающие этим свойством,выделены из многочисленных различныхорганизмов. 15Надокисные дисмутазы, содержащиемедь и цинк в их активных участкахобнаружены в цитоплазме эвкариотов.Эти энзимы представляют собой двумерные молекулы, которые проявляют 20высокую степень гомологии в свойст-.венной им последовательности аминокислот Я .Другой класс надокисньгх дисмутаз,фсодержащих железо или марганец в ихактивных участках, обнаружен в прокариотах и эвкариотной митохондрии.Следовательно, у этого класса имеетместо большое сходство в составеаминокислот и-оконечных амино 30кислот. Однако существенная гомология между двумя классами надокисныхдисмутаз отсутствует. По-видимомуфункция дисмутаз, состоит в защитеклеток аэробных организмов от токсических воздействий перекисногорадикала, являющегося побочным продуктом реакции кислорода в организме. Считают, что надокисный радикалвызывает различные воспалительные40процессы в тканях и что он содействует появлению ревматоидных артритов, По этой причине предложено использовать надокисную дисмутазу для лечения воспалительных заболеваний и,воз 45можно, ревматоидных артритов, Терапевтическое действие содержащей медьи цинк надокисной дисмутаэы в отношении воспалительных заболеваний установлено опытным путем, Таким образом, большое значение имеет разработ 50ка способа измельчения содержащеймедь и цинк надокисной дисмутазы впромышленном масштабе и с высокимвыходом,55Среди содержащих медь и цинкнадокисных дисмутаз в наибольшей степени изучен бычий энзим, Так,известны полная последовательность аминокислот и рентгеновская структу. ра этого энзима. Кроме того, проведены исследования разнообразными спектроскопическими способами.Содержащую медь и цинк надокисную дисмутазу, быков и других высших кивотных, извлекают, например, из органов и тканей, в особенности из печени, путем экстрагирования мелко изрубленной ткани холодным буферным раствором, а в случае крови путем гемолиза эритроцитов. После этого, в обоих случаях, из полученного раствора водорастворимых протеинов производят извлечение НЕД.Извлечение осуществляют, например, путем Фракционированного осаждения органическими растворителями или сульфатом аммония, в произвольном случае - в сочетании с денатурацией лобильных по отношению к нагреванию протеинов, вызываемой нагреванием в присутствии ионов двухвалентных металлов, или хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе или на других ионообменных смолах. Низкомолекулярные загрязняющие примеси обычно удаляют из очищенного раствора путем диали:а или подвергают такой раствор фильтрованию с помощью геля на геле декстрана.Известен способ очистки энзима посредством пропускания раствора эн .; зима через буферный раствор, обладающий ионной силой до 10 молярной концентрации, при рН 5,5-8, находящийся в колонне с ионообменной смолой, причем эта смола обладает группировками слабоосновного или слабокислотного характера, привлекающими ионы противоположной полярности. В качестве смолы может быть использована карбоксиметилцеллюлоза, однако этот продукт в интервале рН 5,5-8 не обладает противоположнойполярностью относительно НЕД 21.Известен двухфазный способ извлечения содержащей медь и цинк надокисной дисмутазы из дрожжей согласно которому полученную после замораживания и оттаивания плотную дрожжевую массу, перемешивают приблизительно в таком же объеме смеси этанола с хлороформом в объемном соотношении 5:3 в течение нескольких часов прио25 С. Затем смесь центрифугируют, всплывший прозрачный слой смешивают45 50 55 с твердым вторичным кислым фосфатом калия (КНР 04), выделенную солью органическую Фазу отделяют иосветляют центрифугированием. Послеэтого осаждают протеины добавлениемхолодного ацетона, осадок повторнорастворяют в холодном фосфатномбуфере при рН 7,8 и очищают от имеющих коричневатый цвет примесей микрогранулированной дизтиламиноэтилцеллюлозой ДЕ. Светло-зеленыйфильтрат диализуют относительно фосфатного буфера при рН 7,8 и послеосветления центрифугированием кроматографируют на колонке, содержащейде-з 2 з .В результате обработки водныхрастворов протеина согласно известному способу или не удается получитьдостаточно чистшй продукт, или жепроцессы настолько сложны, что приводят к слишком малому выходу чистого энзима,Цель изобретения - увеличение выхода и повышение степени чистотыфермента,Для достижения цели согласно способу выделения надокисной дисмутаэыиз белковых растворов, включающемухромстографию ферментсодержащегобелкового раствора на катионообменной смоле, хроматографию ферментсодержащего белкового раствора ведутпри рН 4,7-5,0 на катионообменнойсмоле с той же полярностью, что инадокисная дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы используют карбоксиметилцеллюлозу или декстраны, содержащие карбоксиметильные или сульфопропильные группы,или агарозы, содержащие карбоксиметильные группы.П р и м е р 1Процесс согласно физобретению обеспечивает хорошеевыделение НЕД иэ смеси с другими,имеющимися в наличии протеинами, вводных растворах, полученных из ука.занных. различных сырьевых материалов, несмотря на то, что согласнотеории монообменные смолы проявляютсродство лишь к веществам, имеющимпротивоположную полярность. Такимобразом, катионообменные смолы и НЕДмогут иметь одну и ту же полярностьв предлагаемом интервале рН.ФВ качестве катионообменных смолмогут быть использованы следующие;различные марки карбоксиметилцеллю 5 1 О 15 20 25 30 35 40 лозы, в частности КМи КИ(фирмы "Ватман Лимитед", Великобритания), карбоксиМетилцеллюлоза КИСефацел (Фирмы "Фармациа Файн Кеми-. келэ АБ", Швеция), имеющий поперечные связи декстран, замещенный карбоксиметильными группами, под названием КМ-Сефадекс (чирья: "Фармация Файн Кемикелэ АБ"), имеющий поперечные связи декстран, замещенный сульфопропильными группами, под названием СП-Сефадекс (фирма "Фармациа Файн Кемикелз АБ"), и имеющая поперечные связи агароза, замещенная карбоксиметильными группами, под названием КИ-Сефароза КЦБ (фирма "фармация Файн Кемикелз АБ").Хроматографирование раствора на катионообменной смоле может осуществляться периодически путем перемешивания гранулированного ионообменивающего продукта в растворе, однако более выгодно осуществлять эту операцию в колонне. Такая операция легко осуществима в условиях крупномасштабного производства и обеспечивает адсорбцию всего энзима на ионообменной смоле.После очистки раствора посредством ионообменной хроматографии, активные фракции продукта, отмытые иэ адсорбента, можно дополнительно очищать по известному способу фильтрования с применением геля или фракционированного спиртового осаждения, дополнительно подвергая очищенный продукт хроматографировачию один или несколько раз, Предпочтительно диалиэовать активные фракции против дистиллированной воды и концентрировать досуха, желательно путем высушивания вымораживанием. П р и м е р 2. 2,5 л диэтилового эфира добавляют к 20 кг хлебопекарных дрожжей (ЗассЬагошусез сегечдэда 1) и смесь оставляют на 30 мин при перемешивании, После дополнительного примерно 2-часового перемешивания при 25 ОС добавляют 20 л горячей воды, доводят рН до 7,5 и продолжают перемешивание 4 часа при 45 С. После дальнейшего 16-часового перемешивания, сопровождающегося постепенным снижением температуры до 25 С, доводят рН до 4,8 и суспензню осветляют центрифугированием при 2000-кратном значении С в течение 30 мин.Для удаления соединений с низкой молекулярной массой полученную после центрифугирования жидкость пятикратно разбавляют буфером в виде 0,01 М раствора ацетата натрия при рН 4,8 и сокращают в объеме до 10 л, применяя ультрафильтрование. Последнюю процедуру повторяют дважды.К концентрированному раствору 10 добавляют 1 л микрогранулированной карбоксиметилцеллюлозы КМ(фирма "Ватман Лимитед" ), которая уравновешена с помощью 0,025 М раствора ацетата натрия в качестве буфе ра, и смесь перемешивают 1 ч. Карбоксиметилцеллюлозу собирают в колонну диаметром 30 см, промывают 10 л буфера г виде 0,025 М раствора ацетата натрия при рН 4,8 и перено сят в колонну диаметром 10 см. В этой колонне осуществляют отмывку из адсорбента раствором ацетата .натрия при наличии линейного графдиента концентрации (0,025-0,200 М) при рН 4,8 в общем объеме 6 л. Скорость перемещения потока 400 мп/ч. Собирают фракции по 30 мл. Собранные активные фракции, имеющие интенсивно-красную окраску, объединяют 30 и концентрируют посредством ультра- фильтрования до проведения высушивания вымораживанием,Пробу, полученную после высушивания вымораживанием, повторно растворяют в 50 мл 0,025 М раствора ацетата натрия, служащего буфером, при рН 4,8 и переносят в 5 40 см колонну с гелем декстрана (Сефадекс ГСуперфайн, Фирма "Фармация Файн Ке микелз АБ"), уравновешенного относительно ацетатного буфера. Ьаходящийся в колонне адсорбент отмывают 1 л 0,025 М раствора ацетата натрия при рН 4,8 и собираю; фракции по 45 5 мл. Скорость движения потока составляет 110 мл/ч, В результате хроматографирования на геле зеленая, содержащая медь и цинк, перекисная дисмутаза отделяется от красного гемипротеина, хотя обе полосы расположены очень близко.Активные Фракции объединяют и переносят в 510 см колонну, заполненную СМи уравновешенную 0,025 М 55 раствором ацетата натрия при рН 4,7, Адсорбент, находящийся в колонне,отмывают при наличии линейного градиента изменения концентрации ацетата (0,025-ф 0,200 М) при рН 4,8. Применяют общий объем 1200 мл при скорости движения потока 200 мл/ч и собирают фракции по 6 мл, Активные фракции объединяют, диализуют относительно дистиллированной воды и высушивают вымораживанием.Фильтрование с наличием геля можно повторить при проведения осаждения спиртом, Пробу, высушенную вымораживанием, после периодически проведен. ной операции с СМрастворяют в 100 мл буфера в виде 0,005 М раство-. ра фосфата калия при рН 7,0 и постепенно добавляют 57 мл этанола. После 10-минутного центрифугирования при 13000 об/мин добавляют еще одну порцию 166 мл этанола к жидкости, полученной после центрифугирования. Осадок собирают центрифугированием при 13000 об/мин и повторно растворяют в 50 мл буфера в виде 0,025 М раствора ацетата натрия при рН 4,8. После этого пробу переносят в колонну с СМ, как описано выше активные Фракции диализуют против дистиллированной воды, затем высушивают вымораживанием.Результаты очистки даны в табл,1.Выход после фракционирования с применением КМ, что предусматривает 115-кратную степень очистки по отношению к концентрату после ультрафильтрования, составляст 753 от общего числа единиц в концентрате. Если катионообменное хроматографирование проводят таким же образом, но с применением других катионообменных смол получают следующие выхода НЕД, Х:КМ75Км61КМ-Сефадекс Г 50 75КМ-Сефароза КЛБ 85СП-Сефадекс 64П р и м е р 3, Гемолиз и очистка гемоглобина.7 л декантированной крови, которая уже содержит около 2 л плазмы и такйм образом соответствует приблизительно 5 л уплотненных кровяных%телец, смешивают с 7 л 967-ного этанола при интенсивном перемешивании. Через 1 ч добавляют 15 л деионизированной воды и продолжают перемешивание еще 30 мин.о7 11844Суспензию центрифугируют на центрифуге с к-рзинкой, типа МБЕ, приблизительно при 2000 об/мин и полученную йлотную массу гемоглобина промывают 2 л воды до опустошения центрифуги. Получают 29,1 л выделенной на центрифуге жидкости.Выделение углекислотной ангидразы.Выделенную на центрифуге жидкость 1 О обрабатывают на 1 Х 12 см цилиндрической .матрице. Сефароза - глицилтирозиназобензолсульфонамид. Углекислотную ангидразу отмывают из адсорбента 0,2 М водным раствором тиоцианата 15 . калия, содеРжащим 0,05 моль арке -сульфата и имеющим рН 6,5.Выделение НЕД и каталазы.Раствор, содержащий НЕД и ката- лазу, доводят дь рН 4,75 с помощью 1 М уксусной кислоты и пропускают через 20 см колонну, заполненную плотным слоем 2 л КИ, который уравновешен в 20 мМ ацетатом натрия в качестве буфера, рН 4,8. Скорость движения потока приблизительно 15 л/ч, Затем ионообменник промывают 15 л буфера в виде 20 мМ ацетата натрия, рН 4,8,Отмывку из адсорбента, находящегося в колонне, производят при линейном градиенте 3 л 1000 мИ и 3 л 200 мИ ацетата натрия и скорости движения потока 1,5 л/ч. НЕД отмывают приблизительно при 150 мМ ацетате натрия. 35Каталазу отмывают из адсорбента с помощью О, 1 М раствора фосфата натрия в виде буфера.Фракции, содержащие НЕД и каталазу, собирают раздельно и ультрафильтруют на мембране ДДСв камере 34 8ДДС-МФ (фирма "Де данкске Суккер Фаб-, рикер А/С").Очистка НЕДРаствор НЕД диафильтруют с применением 10 мМ натрий-фосфатного буфера при рН 7,5 и дополнительно очищают хроматографией на ДЕколонне 5 Я см, уравновешенной 10 мМ натрийфосфатным буфером при рН 7,5. Колонку проявляют при линейном градиенте 2600 мл 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5 содержащего 0-ф 0,125 М хлорид натрия, Скорость движения потока 110 мл/ч. Собирают фракцим по 10 мл.Фракции, содержащие НЕД, объединяют. Удельная активность и адсорбционный спектр свидетельствуют о чистоте энзима.Очистка каталазы.Раствор каталазы после ультрафильтрования очищают путем фракционирования сульфатом аммония.Регенерация колонны КМ. После отмывки каталазы через колонку пропускают 3 л 0,5 М раствора гидрата окиси натрия, затем 3 л воды. Далее через колонку пропускают 3 л 0,5 И раствора хлористоводородной кислоты, после этого 3 л воды и 3 л натрийацетатного буфера при рН 4,8Колонну в заключение обрабатывают 20 мМ натрий-ацетатным буфером при рН 4,8 до тех пор, пока проводимость и рН жидкости, вымытой из адсорбента, не станут такими же, как у буфера. После этого колонка готова для употребления.Результаты выделения и очистки НЕД, каталазы и углекислотной ангид-, разы из 5 л красных кровяных телец приведены в табл. 2.лобо хх х Еф хх ц 6э х аох э ц х ео х ю х ОЭ СО ОО л д д д д 1 1 л еЯ х ю)Я 2 Э д з о о ю о дЕ о д х ф д о о .д ф х о ио 11 Хх оа 3доЯфо эд Гх охМ 3 1НЕД, Выход,Ж Объем, л Условия процесса ангидраза, мг 7 л декантированной крови+7 лэтанола14 Добавление 15 л воды 29 Центрифугирование и промывка 100 11000 29,5 365 100 1600 100 1,3 300 82 бтмывка иэадсорбента каталазы 1400 87 Ультрафильтрование раствора НЕД 0,25 290 79 0,30 290 79 Редактор В.Петраш Заказ 6288/57 Тираж 721 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г,Ужгород, ул,Проектная, 4 Аффинитное хроматографирование и отмывка из адсорбента углекислотной ангидразы Колонка СМиотмывка из адсорбента НЕД Колонка ДЕиотмывка иэ адсорбента Составитель А.МакаровТехредМ.Гергель Корректор И.Эрдейи