Способ получения водорастворимых антигенов

(19) (11) ГОСУД ИСТОЕ ПО ДЕЛАМ И ННЫЙ КОМИТЕТ СССР РЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ РЕТЕНИЯ,АВТОРСКОМ ТЕЛЬСТВУ(54) (57) спос ВОРИЮХ АНТИГ ных и человек ции, обработк , последую.(им ц выделением це л и ч д ю щ и целью повышен дукта, гомоге хлористого к чения рН от 5 Об ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТ" ЕНОВ из ткани живота путем ее гомогенизаи хлористым калием с ентриФугированием и левого продукта, о т й с я тем, что с ия выхода целевого про нат перед добавлением алия подкисляют до зна 0 до 4,0. И 4 10 ,Н. Носкви скин ормедицва(56) 1. Вязов Оиммунология. И.с. 287. дена Ленинаинский институт 1) А 61 К 3/ОО1 1079Изобретение относится к медицине,а точнее к иммунохимии и касаетсявыделения растворимых антигенов,и может найти применение в медицине,например в онкологии, для дифференциальной диагностики пролиферативных заболеваний и оценки состоянияклеточного иммунитета, в трансплатологии для определения уровня специфических антител при криэах отторже- Ония, а также в биохимии и биологиидля изучения физико-химических свойств , и биологицеской активности антигенов клеточных мембран.Известен способ получения водорастворимых антигенов иэ ткани животных и человека путем ее гомогенизации, обработки 3 И раствором хлористого калия с последующим центрифугированием и выделением целевого продукта Г 3.Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого про"дукта (1 О) поскольку после добавления к клеткам 3 И КС образуется 25вязкий гомогенат, который подвергаютдиализу, что приводит к потере антигенного материала.Цель изобретения - повышение количественного выхода целевого продукта,З 0Указанная цель достигается тем,что при осуществлении способа получения водорастворимых антигенов из ткани животных и человека путем ее гомогенизации, обработки хлористым кали- ем с последующим центрифугированием и выделением целевого продукта, гомогенат перед добавлением хлористого калил подкисляют до значения рН от 5,0 до 4,0, , 40П р и и е р 1. 3,56 г свежей ткайи полуценной в результате биопсии или хирургической резекции, или взятой от трупа не позднее 2-4 ч после .смерти гомогенизируют на ледяной бане в стеклянном гомогенизаторе.Поттера в 0,83-ном растворе МаС 0.04 И трис"НС 1 буфере рН 7.3. температура которого 4-6 ОС (вес: объем 1:9 ), В полуценный гомогенат добав ляют 0,1 И НС 1 до достижения рН 4,5, В подкисленный гомогенат при. постоянном перемешивании вносят по мере растворения сухой КС 1 до конечной кон центрации ЗИ и оставляют при постоян"55о ном перемешивании на 16 ч при 4 С (в холодильнике). Гомогенат центрифугируют при 48 000 об/мин (центрифуга 246ВесЬчап ро,ор 60 Т) 90 мин, при1 04 С, супернатант обессоливают на колонке с сефадексом 6-10 (2,5 10 см),концентрируют на мембранных фильтрахоИИ(при, 4 С) и разбавляют на сефадексе 6-200 (2,5100 см) . Элюциюосуществляют 0,04 И трис-НС 1 буферомрН 7,4, содержащим 0,83 ИаС 1, Материал, содержащий водорастворимыетрансплантационные антигены, выходит во внешнем объеме колонки (пробирки 13-16 на фиг. 1 сплошная линия)Количество полученных частично очищенных трансплантационных антигенов составляет 59,53 от исходнойактивности гомогената.П р и и е р 2. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что материал, взятый вкачестве источника водорастворимыхантигенов хранится от несколькихдней до нескольких месяцев при 20 оС.Выход антигенного материала составляет 593.П р и м е р 3. Все процедуры выполняют как в примереза исключением того, что рН гомогената доводят до значения 4,7. Выход антигенного материала составляет 59,2.П р и м е р 4, Все про гдурывыполнялись как в примере 1 эа исключением того, что рН гомогеяатадоводят до значения 4,9. Выход антигенного материала составляет 58,9.П р и м е р 5 Все процедуры выполняют как в примереза исключением того, что рН гомогената доводятдо значения 5,0, В этом случае де"зокси- и рибонуклеопротеиды выходятв раствор, гомогенат становится вязким и выделение ведется по прототипу. Выход антигенного материала.составляет 13,33.П.р и м е р 6, Все процедуры какв примере 1 эа исключением того, цторН гомогената доводят до значения4,0. Выход антигенного материала составляет 453.П р и м е р 7. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением тоГо, что рН гомогената доводятдо значения 3,5. Выход антигенногоматериала составляет 11/П р и м е р 8. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената дово"дят до значения 2,0. Выход антигенного материала составляет 2 Й,з 10792 П р и м е р 9. 8 се процедуры выпол няют как в примере 1 за исключением того, что сначала к исходному гомогенату добавляют сухой КС 1 до конеч" ной концентрации ЗМ, а затем в полученный вязкий гомгенат добавляют 0,1 М НС 1 до исчезновения вязкости. Это достигается при значении рН 2,0, 8 ыход антигенного материала составляет 1,9. 10 20 На чертеже представлены профили элюции препаратов растворимых транс- плантационных антигенов на сефадексе С.35Сплошная линия - профиль элюции антигенного материала, полученного по предлагаемому способу, пунктирная линия - разделение препарата, полученного по прототипу. На колонку 40 Предлагаемый способ получения водорастворимых анти генов поз воляе 1 получать, в отличие от прототипа, довольно высокое количество раство римых антигенов (45-6011 вне зависимости от того, использовались ли в качестве исходного материала живые клетки или ткани животных ио человека, хранившиеся при -20 С. Последнее оцень важно, так как позволяет накапливать материал и длительно сохранять его при отсутствии возможности провести выделение антигенов непосредственно 25 после забора материала. Проведена сравнительная оценка распределения на сефадексе 0-200 антигенного материала, полученного по предлагаемому способу и по прототипу, 30 46 4с сефадексом 0-200 2,5100 см)уравновешенную 0,04 М трис-НС 1 буфером, содержащим 0,84 йаС 1, нанесены равные объемы проб препаратов(11 мл 1, полученных двумя разнымиметодами, содержащие одинаковуюконцентрацию белка (10 мг/мл). Элюцил проводится тем же буферным раст"вором при скорости 20 мл/ч. Антигенный материал, определяемый по методу ингибирования цитотоксическогодействия специфической антисывороткисодержится в 13- 16 фракциях, т.е,в свободном объеме колонки. Из представленных на чертеже профилей элюции видно, что препарат, полученныйпо предлагаемому методу, присутст"вует в максимально недеградированнойФорме, по сравнению с антигенным препаратом, полученным по прототипу.Удельная активность препарата, полученного по предлагаемому способу вобъединенных Фракциях 13-16 составляет 214 АЕ/мг по сравнению с удельной активностью препарата полученного по прототипу и равной 110 АЕ/мг.водорастворимых антигенов позволяетрасширить сырьевую базу (возможностьиспользования наряду с живыми клетками материал, хранившийся при -20 С),увеличить количественный выход растворимого антигенного материала с10- 133 до 55-594, получить антигенный материал внедеградированнойФорме с большой удельной активностью,уменьшить затрачиваемое по получению антигенов рабочее время на 15203 за счет ликвидации этапа диализа.ее т шПодписное Заказ 1196/3 Тираж.688 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5