Способ получения ротавирусных антигенов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЕЕ 1111 12 М 7/00 А 61 К 39/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯЧПРИ ГКНТ СССР САНИЕ И 3БР 1=Я-ДНЯ ВСесовгнцРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Гирин И.И.Бойко,лик и В,М.Плугатьерь 8.097(088.8) рское свидетельство кл. А 61 К 39/225,О/00, 1980. ОБ ПОПУЧЕНИЯ РОТАВИРя УСНЫХ ретение относится к меди Изобретение относится ки ветеринарной вирусологиити к технологии получения имедицинскойв частнос- антигенных х мин Я й добавр ош сти, аминоние адоса:тигеЕМОИ Л тельно ы Игла(71) Киевский государственный интитут усовершенствования врачей СМЗ СССР.Цель изобретения - повышение выхода биомассы ротавирусных антигенов.Способ осуществляют следующим Образом. В культуру клеток человека или , животных, предварительно обработанную гидрокортиэоном в дозе 0,03-0,07 мг/мл среды в течение 24 ч, вносятротавирус в заражающей дозе 0,35 ЩЛб/мл и инкубируют в термостате для накопления биомассы ротавируса в течение 48 ч. Затеи клетки вместе с культу- ральной средой трижды эаморажнвают и оттаивают, клеточный детрит осаждают центрифугированием, вируссодержащую надосадочную жидкость обрабатывают 1 М НС 1 до рН 4,0-5,0. В подкисленную надосадочную вируссодержащую ской и ветеринарной вирусологии, вчастности к технологии полученияантигенных препаратов. Цель изобретения - повышение выхода биомассы ротавирусных антигонов, Это достигаетсяпредварительной Обработкой культурыклеток Гед 1 эокорпэоееои В количестве0,03-0,07 мг/мл эа 24 ч до заражения,а эатегя внесением вируса и после завершения его репродуктеии очисткойи концентрированием антигенов адсорбпией на частицах сорбента - ами оэтоксиаэросила при кислых значенияхрН 4,0-5 0 и элеоееией при щелочныхзначениях рН = 8,2. 12 табл.;лцкость вносят 175 мгл аииноэтоаэросела для адсорбции ротавируснан егеноввстряхивают 5 мин цеериАугируют при 2 тыс, Об/мин - 15после чего надо адок. уже не содежащий ротавируснь,х антигеноя, удалют. К Осадку, представляющему собвирусный антиген, сорбированныйчаетецагпя аминоэтоксеаэросила(рН 8,2) в количестве 1 Е по оте нию к исходному объему жидко встрялвают и Освобождаеот от этоксиаэроснла цееетреФугиров притыс. об/мин - 15 минут док - готовый продукт,Н р и и е р 1, 11 о.лучение -Ов ротавируса Обезьян БА Во заев.".Сь клеток перевива нии почки свиньи СНЗВ в пита среде (45 г. среды 199,45 К среди 107. сьтзораГКН круппога рагят 010 скота) при посевной концентрации клеток 150 тыс/лл вносят 0,03 мг /мл гидрокортизоца, я при пасевцой концентрации 200 тыс. кл./мл - 0,07 мг/мл. Дозы гш 1 закартизаца 1 Нже 0,03 мг/мл ЦЕттаСТЯТОЧЦО ЭйаЕКТ 1 ВЦ 1, а ВЬИПЕ 0,07 М 1/Мит Гр 1 ВОТ 51 Т .;. ут цЕГЕНИ 1 О рЕГтЗОЧУКЦИ ПОт Я З 1 ЗУСОВ В КЛЕТОЧНЫХ 10культурах (см. табл. 1), ОбработаннуюВЗВЕСЬ КЛЕ ГОН Раэ.итнашт И ВЫРЯЩИВаОт ВО вряцятотНхся бутылях Б устрайстВе дп 5 раллевца а ,"ттт 1-.,Г 1 т"тт)ОВяния, 1 я тзОртПЛтьттпявюзт 1 Гя тт ртов э . 4 Ч ОНОСПОИ клеток, ГретВарельца Отмытый от сызоротки ря тзара Эрзтя (рН 7,6), наносят роиЯВЩзус Отсзьян БЛ 1 1 В Даэе 0,.25 ТЦДт,-/т:л, 3 Гем через 1 ча адсорбци Вт 1 руст Иа клетках 11 ри 37 С 20 бутыли зап ваот Оддерживатот 1 ей средой следуктщега састаза-; 50% средь 199.,507 среды 111 ла 1 ткг/мт трипсина.Пасп Досттгксцця максимального цт 1 ТОПятВЕСКОГО ЭтЬтЕктя ЧЕРЕЗ 48 Ч 25 ," ПЫЛИ 55 тОЦС 1 ЦЗЦО ЬетРЯХИВаОт И ПЕРЕ 1 Зодят Кт 1 Е т 1;и .зо тЗЗЗРСЬ т,От ОруО ТПИж ды замор;.;яцзяот и оттанваот, клеточные Обломки удаля;.т цсцтрииугираванием при 2 Гыс, аб,т 1 и - 15 миц. 1 Яцосадок 1 О ."161 л 1)1 от р ПОкто ля 1 от 111 1 С 1 ДО рН 4,0- 5,0. Вносят 175;г/и ЯттинОЗГОксиаэросила Встряхивазот 5 мин ца лаборатар-.ЦЫХ тЕНКЕРЯХПОСЛЕ ЧЕГО ПОВТОРНО центри"у 1111 уют притыс. Об/миц в те чепце5 мин, Нядасадок удаляют и элю 1 груют 1 зата 11,рус 1 ье анти 1 ены 05 И тр 1 лс-буйером (рП,1,.) В оаъем, составпя 1 ощии % От исхОднОГО.Экспери;тецтальць:е данные по влиянио рН реакционной среды на адсорбцию ротавируса обезт яц НЛ представленыВ Табл, 2 усяновлетз что 93,8% ратавируса и,.ссрбируе"ся ца частицах ятиназтоксиязрас 1 и 1 я цр 1 л кисзых значениях 1.1 (4,0-5,0) .Дале па лз 1 ЕнтО ЗтойЕКГИВНОСТИ элюцин роианирУСВ абез.,ян 8/т;11 сямина этак я рас 1 ля В зйвисиОст 11 О Г р 1. Зл оируБЦЗО ра ств Ора преДстЯВле 5 нь 1 в таб;т, 3., 1 яивысшей элюнруощей спасаот 10 стью абз 1:Дяе т 0,05 11 трисбутоер с рП Ят.,Станц 1 ТЯГьцтс даннье:; пака зываощие пре:уществя предложенного спосо-, ба по сравцегцт,о с прототипом на эта.ПаХ ОЧИСТКИ И КатпЕЦТРИРОВЯЦИЯ Рата" вируса сбез.5 тц ЗАпа таким характеристикак к.;. Об-:етт содержание белка, титр в РАНГА антигена и выходконечного продукта, представлены втабл. 4П р и м е р 2. Получение антигеновротявируса свиней, штамм "К",Зо Взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭЙС в питательнойсреде (45% среды 199,45% среды Иглаи 107 сыворотки крупного рогатогоскота) при посевной концентрации клеток 150 тыс/мл вносят 0,03 мг/млгидракортизона, я при посевной концентрат,лиОО тыс,.кл/мл - 0,07 мг/мл,Дозы гидрокортизана ниже О, 03 мг/млнедоста Гачно эдйективц.а выше0,07 мг/мл приводят к угнетениюрепродукции ротявирусав в клеточныхкультурах. Данные па подбору оптимальной дозы гидрокартизона приведе -ны В табл. 5. Обработанную взвеськлеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях в устройстве дляроплерного культивирования, На САормировавшийся через 24 ч моцослойклеток, предварительна отмытый от сыВоротки раствором Эрла (рН 7,б), наносят ротавлрус свиней, штамм "К" в до,зе 0,25 ТЦД/кл, Затем через 1 ч адсорбции вируса на клетках при 37 Сбутыли заливают поддерживающей средойследуо;его состава: 50% среды 199,50%асреды Игла, " мкг/мл трипсицаПостпе достижения максимального цитопатического ЭЬАекта через 48 ч бутыли интенсивно Встряззлваот и пере - Водят клетки во взвесь, которую трижды замараживают и аттаиваот, клеточные обломки удаляют центрифугироваци-, ем при 2 тыс, аб/мин - 15 мин. Надо- садок отбирают, подкисляют 11 тт НС 1 до рН 4,0-5,0, вносят 175 мг/л аминоэтоксияэросила, встряхивают 5 мин на лябора "арных шейкерах, после чего повторно центритоугируют при 2 тыс. об/мин - 15 мин. Нядосадок у 11 аляот и элюирутот ротавирусные ацтигены 0,511 трис-буоером (рН 8,2) в объем, составляющий 1% от исходного.Экспериментальные даццтс па Влиянию рН реакционной среды нв адсарб 1 тию ратявируса свиней, штамм тК" представле и, в табл, 6. Устаповлено, чта93,87, ротавируса стзиней, штамм "К" адсорбируется на частицах яминоэтаксияэросила при кислых значениях рН (4,0-50).,яннье па этектитцасттл элюпии .1 тотявируса свиней, штамм тКс амино 1700054аэтоксиаэросиа . .;ависимости от рН элюирующего раствора представленытабл 7. Наивысшей элюирующей способностью обладает 0,0511 трлс-боер с рН 8,Сравнительные данные, показывающие преимущества предложенного способа по сравнению с известным на этапах очистки и концентрирования ротавируса 10 свиней, штамм "1(" по таким характеристикам, как объем, содержание белка, титр в РНГА антигена и выход конечного продукта, представлены в табл.8.П р и м е р 3. Получение антигенов 15 ротавирусов свиней, штамм "Т".Во взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭВ в питательной среде (45" среды 199,457 среды Игла и 10 Х сыворотки крупного рогатого ско 20 та) при посевной концентрации клеток 150 тыс.кл/мл вносят 0,03 мг/мл гидрокортизона, а при посевной концентрации 200 тыс.кл/мл - 0,07 мг/мл, Лозы гидрокортизона ниже 0,03 кг/мл недо статочно эдйективны, а выше 0,07 мг/мл приводят к угнетению репродукции ро - тавирусов в клеточных культурах, Данные по подбору оптимальной дозы гидрокортизона приведены в табл, 9. 30 Обработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях в устройстве для роллерного культивирования. На сформировавшийся через 24 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором Эрла (рН 7,6), наносят ротавирус свиней штамм "Т" в дозе 0,25 Т 1 Д /кл. Затем через 1 ч адсорбции вируса на д 0 клетках при 37 С бутыли заливают пододерживающей средой следующего состава: 507. среды 199,50 Е среды Игла, 1 мкг/мл трипсина,1После достижения максимального цитопатического эЬЬекта, через 4 Я ч бутыли интенсивно встряхивают и переводят клетки во взвесь, которую трижды замораживают и оттаивают, клеточные обломки удаляют центрийугированием притыс, об./мин - 15 мин. Надосадок отбирают, подкисляют 1 И НС 1 до рН 4,0-5,0, вносят 175 мг/л амино - этоксиаэросила, встряхивают 5 мин на лабораторных шейкерах, после чего повторно центриЛугируют при 2 тыс. об/мин - 15 мин. Надосадок удаляют и элюируют ротавирусные антигены 0,51.на, мг/млротавируса обе:-ьян8 А - 11. 1.,", ТГр/мл 0,01 00 0,03 0,05 ,О, 06 0,0708 0,1 3,5о 6,3 7,0 7,00 6,0 1,0 трис-бубером (рН 8,) в объем, сос -тавляющий 1,. от исходного.Экспериментальные данные по влиянию рН реакциопноч среды на адсорбцию ротавируса свиней, штамм "Т",представлены в табл, 10. Установлено,что 927 ротавируса свиней, штамм "Т",адсорбируется на частицах аминоэтоксиаэросила при кислых значенияхрН (4,0 - 5,0) .Данные по эаАективности элюцииротавируса свиней, штамм "Т" с аминоэтоксиаэросила и зависимости от рНэлюирующего раствора представлены втабл. 11, Наивысшей элюирующей способностью обладает О, 05 М трис-боерс рП 8,2,Сравнительные данные, показывающиепреимущества предложенного способа посравне 1 лию с известным на этапахочистки и концентрирования ротавирусасвиней, штаммоТ по таким характеристикам как объем, содержание белка,титр в РИГА антигена и выход конечного продукта, представлены в табл,12.бормулаизобретенияСпособ получения ротавирусных антигенов, включаю:шлйл выращивание ротавирусов в клеточных культурах, их выделение из инпщированных клеток споследующей очисткой и концентрированием:, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения выхода целевого продукта, в среду добавляют гидрокортизон в количестве 0,03-0,07 мг/мльза 24 ч,до заражения клеточной культуры, а очистку : концентрированиеосуществляют адсорбцией ротавирусногоантигена на сорбенте при кислых значениях рП 4,0 - 5,0 с п.следующей элюцией при щелочных значениях рН 8,2.Та блица 1Влияние доз гидрокортизона па ин-пекционный титр ротавируса обезьян1700054 Та блицаВлияние р 11 реакционной среды наадсорбцию ротавируса обезьян Процент адсорбированного ротавирусаобезьян 8 А, % рН реакционной ср еды Та блица 3 ЭФФективность элюции ротавируса обезьян с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН э,пюирующегораствора Элюирующая система рН элюирую 11 ейТитр ротасистемы вируса БА в РНГА фп/и 25 б 01280204805120 7,2 8,0 8,2 9,3 1.2.3.4. Та блица 4Сравнительные характеристики биомассы продукта Антиген- Удельная ная ак- антиген-. Объем, мл Ис следуежпйматериал Способ Степеньконце нт Содержание белрирования, % исход- конный центка поЛоури,мг/мл тивность ная активтитр в ность, РНГА ед/мг м-л рат РотавирусобезьянЯАСпособ получения анти 1:640 20 100 5 Ротавирус обезьянЯАСпособ получения рота 1;20480 11252 100 100 1 1,82 гена для диагностики вирусногогастроэнтерита (поизвестному способу) вирусных антигенов (по предлагаемому способу) ф 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0 8,0Раствор ЭрлаДистиллированная вода 0,05 И трис-бубер 0,05 И трис-буд)ер 75,0 93,8 93,8 93,8 87,5 87,0 75," 75,010 17 Ю 154 Продолжение табл.6 Та блица 5Влияние доз гидрокортизона наинфекционный титр ротавирусасвиней Доза гидрокортизона, мг/мл 10 Та блица 7Эффективность элюции ротавирусасвиней с аминоэтоксиаэросила взависимости От рН элюируюшегораствора 15 т рН элюир ующейсист емы ТитрротавиЗлюир уюшаясистема руса свиней,штамм Кнв Р 11 ГА Та блица 6Влияние рН реализационной средына адсорбцию ротавируса свиней 25 1. 2.рН реакционнойсреды Процент адсорбированного ротавируса свиней, штамм "К", % 2560 7,2 1280 8,0 20480 30 3,5 4,0 75,0,938 5120 Та блица 8Сравнительные характеристики биомассы продукта Тмл Исследуемыйматериал Способ Объем,Степень Содержание белЛнтигенная активность Удельная антигенная КОНцентриисходный концентрат Ка. ПОЛОУРи,мг /лл активность,ед /мг рова" ния, Х титр вРНРА Способ по- Ротавируслучения свиней,антигена штамм "К" 100. 5 8,5 20 1;640 75,2 для диагностики вирусного гастроэнтерита (поизвестному способу) 0,01 0,02 0,03 0,05 0,06 0,07 0,08 0,10 Инфекционный титрротавируса свиней,штамм "К",Т 1 Л р /мл 3,5 5,0 6,3 7,0 7,0 7,0 6,0 1,0 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0 8,0 Раствор ЭрлаДистиллир Ованная вода0,0511 трис -буфер0,0511 трисбуфер 93,8 93,8 87,5 87,0 75,0 75,01700054 сследуемыйматериал Способ СтепеньконОбъем, мл Антигенная акСодержание белУдельнаяантигенная центрирования, Ж исход - концентный рат ка поЛоури,мг/мл активность,ед/мг тивностьтитр вРНГА м-л Ротавирус Способ пслучения ротави 1:20480 10779 100 русных антиге - нов (по прецлагаемомуспособУ) Та блица 9 Влияние доз пщрокортизона на ин.фекционный титр ротавируса свиней Доза гидрокорти -зона, мг/мл Та блица 11Эфектинность элюции ротавируса свиней с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН элюирующего раствора Титр ротавируса свиней, штамм"Т" в РНГА рН элюиРующейсистемы Элк ир ующаясистема Рп/и Таблица 10 Влияние рН реакционной среды на адсорбцию ротавируса свиней Раствор Эрла 7,2 Дистиллированная вода 8,0 0,05 И трисбуФер 8,20,05 И трисбуфер 9,3 1280 рН реакционнойсреды 640 3. 51 20 2660 3,5 4,0 73 92 0,01 0,02 0,03 0,05 О,. 06 0,07 0,08 0,1 1 свиней,штамм"1(" 100 1 Инфекционный титрротавируса свиней,штамм "Т",1.8 ТЦ;/мл 1,5 3,095,0 5,0 5,1 4,0 0,5 Процент адсорбирован -ного ротавируса свиней,штамм "Т" 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0 8,0 Продолжение табл,8 Продолжение табл 10 92 92 87 87 73 731 700054 Та блица 12Сравнительные характеристики биомассы продукта Объем, мл Исследуемыйматериал Способ Степенькон- центриСодержание белАнтигенная активностьь Удельнаяантигенная исходный концентка по Лоури, мг/мл активность,ед/мг рат р онания % титр вРИГА м-л Способ по- Ротавируслучения ан- свиней,тигена для штАмм "Т"диагностикивирусногогастроэнтерита (поизвестно 20 5,5 1;320 58,100 5 му способу) Ротавируссвиней,штамм Т" 100 1 Способ по 1:5120 4266,6 100 Редактор Н.Козлова Заказ 4443 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 лучения антигенов (по предлагаемому способу) Составитель С.ПылозаТехред Л.Сердюкова Корректор А,Обручар