Способ дифференциации вирулентных и авирулентных шигелл

Изобретение относится к медицине, н частности к микробиологии и иммунологии.Известен способ дифференциации нирулентных и анирулентных штаммовг шигелл путем заражения испытуемыми штаммами развивающихся куриных эмбрионов 1 .Однако данный способ не позволяет дифференциронать штамьх с осла.бленной нирулентностью, 1 ОИзвестен также способ дифференциации нирулентных и анирулентных шигелл путем заражениячуго перитониалнных макрофагон 21.Недостатками способа являются низкая точность, поскольку способ н= отражает условчя естественного тече-, ния дизентерийной инфекции, а также длительность проведения анализа.Целью изобретения является ускоре- .Д ние способа и выявление штаьжов с по- ниженной вирулентностью.Поставленная цель достигается тем, что согласно сгссобу .дифференциации нирулентных и анирулентных шигелл25 путем перорального заражения животных с последуюцим учетом полученных результатов, иэ селезеики зараженных животных выделяют цитоплазматическую Й лиэОсОмальную Фракции силенсцитонуЪ определяют н них активность катепси- з на,о и при понышянии яго активности по сравнению с нормой в цитсплазмиче. ской фракции дифференцируют нирулентный штамм а при поныаении его активности н лиэосомальной Фракции35 авирулентный.СпОсОб О суше ствляЯтся следуюВЩм образом.Итаммы шигеля выращивают на обычном мясопептонном агаре н течение 40 18 ч при 37 фС. Бактерии смынают стерильным Физиологическим раствором.Мыаей линии СНА в количестве 7 шт заражают интрагастрально в дозе 2 х 10 микр клеток по оптическому стандарту. Через 18-24 ч после заражения мышей забивают, обезглавливая. извлеченные селезенки помещают в хо" лодный 0,25 м раствор сахарозы в соотношении 1;10 по весу на 2 г ткани селезенки добавляют 20 мл раствора сахарозы). Клетки селезенки гсмогениэируют н стеклянном гомогенизаторе. Цитоплаэматическую и лизосомальнуюФракции выделяют методом дифференциального центрифугирования. 55Гомогенаты центрифугируют при 800 об/мин в течение 10 мин, освобождая от ядер, митохондрий и других относительно тяжелых клеточных элементов. Надосадочную жидкость повО торно центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. При этом надосадочная жидкость представляет собой цитоплаэматическую фракцию. Осадок, содержашийлиэосомы, обрабатывают 65 бидистиллированной водой 1."10 нтечение 30 мин, Обломки лизосом удаляют центрифугированием при15000 об/мин н течение 30 мин. Полученная таким образом надосадочнаяжидкость содержит лиэосомальные энэимн,Активность катепсина Ъ н цитоплазматическои и лизоссмальной Фракциях клеток селезенки определяют пометоду Агино 1936), используя нкачестве буфера 2,5-ный растворденатурированного гемоглобина в кислой среде, Результаты выражают в мкгтирозина на 1 мл белка, определяемомпо методу Коогу 1951).При активности катепсинаД нцитоплаэматической Фракции кЛетокселезенки через 18-24 ч после заражения бактериями на 25 и более инеизменной активности катепсина влиэосомальной Фракции по сравнению сактивностью этогс фермента у нормаль.ных незараженных мышей исследуемыйштамм относят к нирулентным и,наоборот, при отсутствии измененияактивности катепсина в цитоплаэматической Фракции и резком (более чемна 25) усилении его ахтивности влизосомальной Фракции по сравнениюс нормой исследуемяй штамм относятк авирулентным.П р и м е р 1. Итамм БсЬ 10 е 11 аГ)ехпег 1 2 а 9 516 выращивают, вводятживотным и определяют актиннОсть катепсина 2Активность катепсина н лизосомальной фракции клеток селезенки в данномслучае равняется 139, в цитоплазматической - О. Следовательно, этотштамм следует отнести к авирулентным.П р и м е р 2. Штамм всЬОе 11 аГ)ехпег 1 В 516 вырашинают, вводятживотным и затем определяют активность катепсинаЗАктивность катепсина В в лизосомальной Фракции состанляет О, в цитоплазматической Фракции - 49 госравнению с нормой. Следовательно,этот штамм следует отнести к вирулянтнымоП р и м е р 3. Необходимо определить вирулентность штамма шигеляНьюкасл У 1221,Гсли активность катепсина Э н цитоплазматической и лизосомальнойФракциях равняется 70 и 0 соответственно, штамм следует отнести кавирулентным.П р и м е р 4. Определяетсянирулентность штамма шигеля НьюкаслР 39. Его нырашинают, вводят животным и в лиэосомальной и цитоплазматической фракциях селезенки мышейопределяют активность катепсина. Влиэосомальной фракции активность катепсина составляет 45, н цитоплаэматической - О по сравнению с конт1075163 Составитель И. ЕмельяненкоРедактор Т. Кугрышева Техред С.Легеза Корректор И. Эрдейи Заказ 490/37 Тираж 823 ВНИИПИ ГосУдарственного комитета СССР по едлам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5Подписное филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 ролем. Следовательно, этот штамм следует отнести к авирулентным,П р и м е р 5. Имеется два штаммашигелл Зонне М 478 и 6, которыенеобходимо дифференцировать по виру-лентности. Определяется активностькатепсина в цитоплазматической и лиэосомальной Фракциях селезенки манейпосле перорального введения живыхбактерий. Активность катепсина дляштаммов Р 478 М 6 в цитоплаэматической фракции 115 и 19, в лизосомальной - 20 и 36 соответственно, Следовательно, штамм 9 478 является вирулентным, штамм Р 65 - авирулентным.,Таким образом, предлагаемый способ диФференциации вирулентных и авирулентных ыигелл с помошью определения активности катепсина О в спленоцитах зараженных перорально животных позволяет в более короткие сроки (в течение 24-30 ч) идентифици ровать вирулентные и авирулентные штаммом шигелл по их способности повышать активность катепсина Э в спленоцитах животных. Предложенный способ дает возможность дифференцировать штаюи шигелл с пониженной вирулентностьв