Способ кинетического измерения концентрации ферментного субстрата

6 А 105 ЗЖ 6 01 й 33/ ОМИТЕТ СССР ТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(54)(57) СПОСОВ КИНЕТИЧЕСКОГО ОПРЕ"ДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРИЕНТНОГОСУВСТРАТА с помощью сопряженных реак;ций, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью ускорения анализа, основную н сопряженные реакция про"водят одновременно, при этом субстраты нли Ферменты сопряженных реакций берут в избытке.К25ЬС 4 1055Изобретение относится к аналити"ческой биохимии, а именно к способамопределения концентрации субстратовферментов, и может быть использовано в биохимии и медицине для определения субстратов.Известен способ кинетического оп"ределения концентрации ферментногосубстрата, включающий добавление кобразцу соответствующего фермента, Опроведение реакции, измерение концентрации образующегося продукта вопределенный интервал времени и расчет концентрации определяемого субстрата, При этом существенно, чтобы 5реакция в выбранном интервале времени протекала по первому или псевдо.первому порядку. В этом случае изме-,ренное значение изменения концентрации субстрата в выбранном промежуткевремени прямо пропорционально искомойначальной концентрации определяемо- .го субстрата 11,Однако данный способприменим восновном для одностадийных реакций.Известен способ кинетического.определения ферментного субстрата спомощью сопряженных реакций, включаю.щий проведение основной реакции до.полного превращения определяемогосубстрата в продукт и определениеполученного продукта с помощью вспо-,могательной реакций кинетическимспособом 2Однако известный способ длителен,так как вспомогательная реакция прово-З 5дится только после окончания основнойреакции,Целью изобретения является ускорение определения концентрации фермент 40ного субстрата.Поставленная цель достигается тем,что нрй осуществлении способа кинетического определения концентрации ферментного субстрата, с помощью сопря-.женных реакций основную и сопряженные45реакции проводят одновременно, причем субстраты или ферменты сопряженных реакций берут в избытке.Способ осуществляют следу 1 ощим об-разом,50 346 2ферменты или субстраты вспомогательных реакций добавляют в избытке. В этом случае основная реакция лимитирует скорость всего процесса в целом. Под основной реакцией цепи реакций понимают ту частичную реакцию, которая обладает самой большой специфич" костью в отношении исходного веще" ства, и, кроме того, благодаря соответствующему выбору параметров реакции может стать реакцией, определяющей скорость всего процесса в целом. Необходимо также, чтобы основная реакция протекала по первому или .псевдопервому порядку. Далее определяют изменение концентрации субстра- та в определенный промежуток времени, Тогда, используя соотношениео - 11., -к, где С " исходная концентрация апре"деляемого субстрата;" изменение концентрации определяемого субстрата в интервале времени (с 2-с 4),и поддерживая величины К,1, С ис постоянными, определяютконцентрацию ферментногосубстрата.П р и м е р. Определение глюкозы в в крови.Исследуемую пробу помещают в реакционную среду, содержащую 80-120 мИ фосфатного буфера (рН 7,0); 0,8 ед/мл или более нероксидазы (КФ .1.1.7);12 ед/мл более глюкоэооксидазы (К 6 1.1.3,4)," 0,6-1,8 мИ 4-аминоан" типирина и 3,0-13,5 мИ фенола. Определение осуществляется согласно следующим реакциям: М -0-глюкоза 3 -Рглюкозо -глюкоза-0-глюкоза+Н О+О - + Ог г оксидазаВ реакционную смесь, содержащую определяемый субстрат, добавляют од" нрвременно ферменты основной и вспомогательной реакций, а также все не обходимые субстраты вспомогательных реакций, Для определения концентраций субстрата кинетическим способом Первая реакция является основ" ной, а вторая и третья сопряжены с ней. Реакции проводят одновременно на центробежном анализаторе, осуществляя первое снятие показаний прибора примерно через 35 сек после смещения реактива с испытуемой пробой, а второе - на 1,5-1,3 мин позд.Заказ 9147/б 1 Тираж 873 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал Е 1 П "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 3 1 нее. Фермент пероксидаза добавляется в настолько увеличенной дозе, что протекающая по псевдопервому порядку основная реакция лимитирует скорость всего процесса в целом. Концентрацию глюкозы определяют путем спектрального изменения концентрации хиноидного красителя. Весь анализ занимает 4-5 мин.Определение триглнцеридов.Триглицериды расщепляют фермента" тивно на глицерин и жирные кислоты, Глицерин определяют согласно следующим реакциямглицерокиназаглицерин+АТФ глицерин- "3"фосфат +АЦФпируваткиназа АДфафоофоеиолпируват --- , -фр АТФ+пируват+ лактатдегидрогеназапируват+НАЦН+Н- лактат+НАЦ 1,Способ осуществляют кинетически с помощью следующих реактивов.Реактив 1: 45-55 мИ фосфатного буфера (рН 7,0); 4,6-3,1 мИ сульфата магния; 300 т 400 мИ додецилсульфата натрия 2,3-3,5 мМ АТФ; 280-420 ьй 05534 б 4фосфоенлпнрувата; 120-230 мИ НАД;7,7 10 еде/л нли более линазы;5,8 10 едал или более эстераэы;9,бе 10 " ед/л или более пируватклиозы ВАКФ 2,7.1,40); 5,3 1 Оед/лили более лактатдегидрогеназы(КФ 1,1.1.27),Реактив 2: 2 р 910 У ед/л или бо"лее глицерокиназы (КФ 2.7.1,30),10 0 концентрации глицерина судят,измеряя образование ИАДН на центро 0бежном анализаторепри 340 нм и 25 С.За счет повышения концентрации ВТФи добавления ферментов вспомогатЕльных реакций основная реакцияопределяет скорость всего процессав целом.Для,осуществления способа смешивают 1 О мкл исследуемой пробы сыворотки с 30-50 мкл физиологическогораствора хлористого натрия и 500600 мкл реактива 1 и инкубируют в те-,чение 10 мин. Затем добавляют реак"тив 2 и через 50 сек снимают первое,а спустя 150-200 сек второе показаниеприбора. Предложенный способ позволяет значительно ускорить проведение анализа (в 3-10 раэ по сравнению с известным).