Способ получения глутаматдегидрогеназы

(5 С 12 И 9 НИЯ ГОСУцАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРЙО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ. (71). Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР:(5 б) 1; НепцвИа 3.А;, ИапевМй Р.1.РпкИХсай 1 оп аЫ Ркорег 1 ев ой 6 цСаюае Зупййаве апй Обцайака ОеЬуйгодепаве Юков Вас 1 Ицв ведаееГХцв.-. В 1 осЬею.;1978, 1973, р.45" 52.2. Юрпас)сег Е.Ь., Вак)сек Й.А. РцгИ 1 сас 1 оп апй Ргорегйез ой НАО- ,сереЫей 1 ОРцсапаВе 0 еЬуйговепаввкгов СбовегЫ 3.ив,ЗВ"- ф ВХосЫш, 31 орЬув В 1 орЬув,", Астап, 1970,р. 212, 225 - 242.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛУТАИЬТДЕГИДОГЕНАЗЫ, предусматривающийкультивирование микроорганизмов - продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода и ми- неральные соли, дезинтеграцию микроорганизмов, получение бесклеточного экстракта с последующим выделением иэ него Фермента с использованием тепловой обработки и хрома,тографии, о т л и ч а ю щ и й с я :тем, что, с целью упрощения процесса, из микроорганизмов используют штамм ИесЬуворМбцв юеСЬапоочогцв ВКИ ВД, культивирование осуществляют в аэробных условиях с использованием метанола в качестве источника углерода, при этом. тепловой .обработке псдвергают.бесклеточный .экстракт, а хроматографию проводят после. довательно сначала на Вбце ВерЬагове С, С 1,-4 В, затем на ДЕАЕ-ЯерЬагозе.ФфИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения глутаматдегидрогеназы, которая используетсядля определения аммиака, сА-кетоглута-,рата, глутамата,5Известен способ получения глутаматдегидрогеназы, предусматривающийкультивирование микроорганизмов Вас 10 Рця пеуаСег 1 цп на питательнойсреде, содержащей глюкозу в качестве 1 Оисточника углерода 1).Известен также способ получениялутаматдегидрогеназы, предусматривающий культивирование микроорганизмов - продуцентов на питательной , 15среде, содержащей источник углеродаи минеральные соли, дезинтеграциюмикроорганизмов, получение бесклеточного экстракта с последующим выделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хроматографии, Согласно этому способу используют анаэробные микроорганизмыС 3 оягЫ 1 ап ЯР 4, которые выращиваютна питательной среде, содержащей вкачестве источника .углерода лизин,,Для выделения фермента биомассу дезинтегрируют, получают бесклеточныйэкстракт, который сначала обрабатывают протаминсульфатом, фракционируют сульфатом аммония, затем подвергают тепловой обработке, повторнофракционируют сульфатом аммония,хроматографируют на ДЭАЭ"целлюлозеи Сефадексе, Выход фермента 41,активность 485 ед/мг белка 2(. З 5Недостатком данного метода является сложность процесса, обусловленная необходимостью создания ана"эробных условий культивирования(удаление кислорода достигается . 40при помощи реакции его с водородэмв присутствии. катализатора или пропусканием через культуральный сосудазота), многостадийностью процессавыделения, а также использованием вкачестве источника углерода ценногопродукта - лизина.Цель изобретения . - упрощение процесса.Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения глу" таматдегидрогеназы, предусматривающему культивирование микроорганизмов - продуцентов на питательнойсреде, содержащей источник углеродаи ьжнеральнне соли, дезинтеграциюмикроорганизмов, получение бескле.точного экстракта с последующим выделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хроматограФии из микроорганизмов испольэуют штамм МеЬуеорМОця вейапоСочогця ВД, культивирование осуществляют в аэробных условиях с использованием метанола в качестве источника углерода, при этом тепловой 65 обработке подвергают бесклеточный экстракт, а хроматографию проводят последовательно.сначала на ВРце 5 ерпагоье СЬВ, затем на ДЕАЕ - сефарозеСпособ осуществляют следующим образом.В качестве продуцента глутаматдегидрогеназы используют штамм .облигатно метилотрофных бактерий МейуОорЬЫця шеЬапоРочогця ВКМ ВД.Для получения глутаматдегидрогеназы бактерии ВКМ выращивают на питательной среде, содержащей метанол, Клетки отделяют от среды центрифугированием, разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора. После центрифугирования бесклеточный экстракт прогревают 20-40 мин при 50- 60 С на водяной бане, коагулированный белок отделяют центрифугированием и раствор хроматограйируют на В 0 це Яерйагояе СЬВ. Далее фракции, со; держащие глутаматдегидрогеназы, хроматографируют на ДЭАЕ-сефарозе. Выход глутаматдегидрогеназы по отно" шению к бесклеточному экстракту 50- б 0, удельная активность препарата 500-550 ед/мг белка.П р и м е р. Бактерии МейуборЬ 3. - .0 ця щеЬапоОоогця ВКМ-ВД выращивают в ферментере с рабочим объемом 60 л на среде следующего состава, г на 1 л .среды: КНРО+2,0; МаСР 0,5, (ИН 4)2 ЯО 4 2,0 р МдЯО 4 7 Й 20 0,025 р Ге 50 7 Н 20 0,01 р метанол 5,0, рН среды доводят до 7,0 10-ным раствором ИаОН. Температура выращивания 35 С, скорость перемешивания 300 об/мин, аэрация 0,5 объема воздуха в минуту на 1 объем среды. После культивирования (22 ч) клетки собирают на сепараторе АСГ-ЗМ,Дальнейшие операции проводят при +4 С, В качестве буферного раствора используют 0,05 М Трис-НСК буфер, рН 8,0. Клетки (100 г) суспендируют в буфере и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе МЯЕ (20 кГц, 51 мин), гомогенат центрифугируют (30000, 40 мин) .Бесклеточный экстракт прогре- вают на водяной бане при 60 С в течение 30 мин и коагулированный белок отделяют центрифугированием.Экстракт наносят на колонку с Веце Яерйагояе СЬВ (30 мл) и элюируют раствором хлористоГо натрия в буфере, градиент концентрации 0 - 0,5 М. Фракйии, содержащие глутаматдегидрогенаэу, объединяют, диалиэуют против буфера и наносят на колонку с ДЭАЕ-сефарозой, элюируют раствором :хлористого натрия (градиент 0 - 0,5 М). Объединенные фракции, содержащие глутаматдегидрогенаэу, обессоливают и к полученному препарату для стабилизации фермента добавляют глицерин до 30.1017730 Э Выход глутаматдегидрогеназы 60,удельная активность 550 ед/мг белка. Предложенный способ получения глутаматдегидрогеназы позволяетуп ростить процесс ее получения фермент получают с хорошим выходом и, высокой активностью.Составитель Т. Иелентьева .Редактор Л. Веселовская Техред И, Коштура Корректор,;, Ц,ШарошйЗаказ 3481/28 Тираж 523 Подписное ВНИНПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП ффПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4