Способ получения мутантов вакцинного штамма е риккетсии провачека

Союз Советскик Социалнстическик Республик. С 12 И 15/00 с присоединением заявки йо(23) Приоритет -Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ВАКЦИОННОГО ШТАММА Е РИККЕТСИЙ ПРОВАЧЕКАИзобретение относится к микробиологии и может ать использовано для получения генетически измененных форм риккетсий, пригодных для применения в молекулярно-генетических исследованиях.Известен способ получения мутантов вакционного штамма Е риккетсий Провачека путем пассирования риккетсий в куриных эмбрионах с последующим отбором мутантов 1 ).Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода мутантов.Целью изобретения является повышение выхода мутантов.Эта цель достигается тем, что согласно способу получения мутантов вакционного штамма Е риккетсий Провачека путем пассирования риккетсий в куриных эмбрионах с последующим отбором мутантов, свежеприготовленную взвесь вакционного штамма Е рикке сий Провачека в концентрации 101 10 ИД кэ/1 г ткани предварительно разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5 и обрабатывают М- метил М" -нитро-й-нитрозогуанидином в концентрации 5-10 мкг 10-20 мин и 1 и 2 пассажи проводят в присутствии 50-200 мкг/эмбрион антибиотика, а30 3 пассаж - 1000-2000 мкг/эмбрион антибиотика.При этом пассажи проводят в присутствии.антибиотика эритрожцина или рифампицина.П р и м е р. Для получения предложенным способом 1:1 утантов риккетсий, устойчивых к антибиотикам, используют свежеприготовленную взвесь штамма Е риккетсий Провачека, полученную из интенсивно инфицированных риккетсиями куриных эмбрионов (107-108 ИД/1 г ткани), извлеченных в день опыта из слабых куриных эмбрионов на 6 сут после заражения. Риккетсии частично очищают от ткани центрифугированием взвеси в цельном молоке при 6000 об. /мин 40 мин на центрифуге с охлаждением. Осадок суспендируют в физиологическом растворе (рН 7,2) в разведении 1:5 и тотчас после приготовления обрабатывают нитрозогуанидином НГ в концентрации 5 мкн 20 мин или 10 мкг 10 мин. По окончании контакта, суспензию разводят до 1:50 физиологическим раствором с 20 молока и вводят в объеме 0,5 мп в желточный мешок 6-7-суточного эмбриона. Для отбора мутантов в желточный мешок эмбриона на пятые сут после зараЗаказ 10898/44 Тираж 531 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб , д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 жения, обработанного НГ взвесью риккетсий, вводят рифампицин (50 100 мкг/эмбрирн) в. дозе, значительно ингибирующий.рост риккетсий исходного штаммаЭти же дозы рифампицина, но вводимде вслед за ннфицированием (в этих условиях действие антибиоти" ка наибольшее). эмбрионов, используют на следующем. пассаже отобранных популяцийПопуляции риккетсий, обнаруженные з присутствии этих доз рифампицина, пассируют на 3-ем пассаже при введении вслед риккетсиоцидной дозы антибиОтика в . 1000 мкг рифампицина/эмбрион. Путем предлагаемого способа получены мутанты штамма Е .риккетсий Провачека, стабильно устой чивые к 2000 мкг/эмбрион рифампицина и 4000 мкг/эмбрион эритромицина.Указанные концентрации .антибиотиков являются предельно допуСтимыми при введании в куриные эмбрибны вследствие их токсичности для эмбрионов.Применение предлагаемого способа повышает выход мутантов, сокращает время отбора мутантов, дает возмож ность отбора к нескольким селективным факторам, а также позволяет получать мутанты, которые без воздействия мутагеном получить не удается. формула изобретения1. Способ получения мутантов накционного штамма Е риккетсий Провачека путем пассирования риккетснй вкуриных эмбрионах с последующим отбором мутантов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода мутантов, свежеприготовленнуювзвесь вакционного штамма. Е риккетсий Провачека в концентрации 10О 10 ИД 9 /1 г ткани предварительно9разводят физиологическим растворомв соотношении 1:5 и обрабатывают йметил-И -нитро-Я-нитрозогуанидиномв концентрации 5-10 мкг 10-20 мини 1 и 2 пассажи проводят в присутствии 50-200 мкг/эмбрион антибиотика,а 3 пассаж - 1000-2000 мкг/эмбрионантибиотика.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что пассажи проводят20 в присутствии, антибиотика эритромицина или рифампицина.Источники информации,принятые во внимание при эксперТизе1. Балаева. Н.И. О вирулентностивакционного штамма Е риккетсий Провачека и некоторые. вопросы биологиириккетсий группы сыпного тифа. Докт.дис., 1971. Москва.