Способ получения галактозооксидазы

Союз Советскик Социалистическмк Республик(53)М. Кл З С 12 й 9/04 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Т.Т,Буглова, Т.С,Кириленко и И.Я.Захарова. Ордена Трудового Красного Знамени институтмикробиологии и вирусологии им. акад. Д.К.Заболотного(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАЛАКТОЗООКСИДАЗЫ Изобретение относится к микробиологической прочь".тленности, а именно к производству ферментных препаратов.Галактоэооксидаза используется в клинических и научно-исследовательс,ких биохимических лабораториях в качестве аналитического препарата для количественного определения галактозы в различных биологических материа О лах.Известны способы получения близкого по механизму действия фермента глюкозооксидаэы путем глубинного культивирования микроскопических грибов Аэрегд 111 цэ и Реп 1 с 1111 цм в присутствии гидрата сульфата магния, первичного кислого фосфата калия и источника азота-нитрата или аммониевой соли. Активность фермента в культуральной жидкости 3-6 тыс. ед/л 111.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения галактоэооксидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего фер-. мент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации с последующим выделением фермента. Способ заключается в глубинном культивировании базидиального гриба Ро 1 урогцэ с 1 гс 1 ласцэ штамм ййй 1. 2903, хранящегося в коллекциях США и Бразилии, Продуцент синтезирует внеклеточную галактоэооксидазу на среде следующего состава, г/л воды:Галактоэа 10Фосфат калия однозамещенный 9Фосфат натрия двузамещенный 8 Сульфат аммония 2Сульфат меди 0,025Сульфат марганца 0,002Сульфат магния 0,2Нитрат аммония 1Дрожжевой экстракт 1рН среды 6,8 - 7,0.Ферментация ведется при 25 С на качалке с 200 об/мин или в ферментерах, продолжительность выращивания 72 96 ч. Галактоэооксидаэная активность культуральной жидкости 20 - 50 ед/мп 12 1.Недостатком данного способа является применение в качестве продуцента галактоэооксидазы труднодоступного для использования штамма йМ 1.2903 базидиального гриба Ро 1 урогцзс 1 гспацци, нестабильность галактозооксндазной активности в культуральяой жидкости при глубинном выращивании продуцента на известной среде (после достижения максимума наблюда,ется резкое падение активности из-эа присутствия в мицелии .гриба ингиби тора неизвестной природы) и наличие примесей каталазы в препаратах галактозооксидаэы, полученных известным способом.4 ель изобретения - получение целевого продукта беэ примеси каталазы, пероксидазы и галактозодегидрогеназы и улучшение таким образом качества продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения галактозооксидазы, предусматривающе- му культивирование,продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом вусловиях аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Гц эаг 1 цв дгав 1- пеагцв ИМВ - Г Р 1060.Штамм Гцэагцв дгав 1 пеагцв ИМВ Г Р 1060 выделен в 1976 г. из корней пшеницы на территории Украины и имеет следующую характеристику;Морфология. Культура Гцэаг 1 цв дгав 1 пеагцв ИМВ - Г Р 1060 образует субстратный, надсубстратный и воздушный разветвленный с поперчными перегородками мицелий. Толщина гиф субстратного и надсубстратного мицелия от 2,7 до 10,8 мк, воздушного 2,0 - 5,9 мк. Конидиеносцы обычно разветвленные в верхней части, на верхних спороносных клетках конидие" носцев (размер 13,5 - 27,0 х 2,7 3,2 мк) располагаются фиалиды по 2- 4 в мутовке, размеры фиалид 10,8 13,5 х 2,7 - 3,0 мк.Конидии веретено-серповидные, суженные к обеим концам, располагаются на верхушках фиалид пачками по 12-38 шт,и больше, образуя пионоты. Размеры конидий 45-86 х 3,5 - 5,4 мк.КУЛьтура Гцэа г 1 цв дгав 1 пеагцв " штамм ИМВ-Г Р 1060 быстро растетна сусло-агаре, агаре Сабуро, Чапека, Чапека-Докса, картофельном агаре, колонии на седьмые сутки достигают 90 мм в диаметре, высота 12-15 мм, Рыхлые, войлочно-клочковатые.Субстратный и надсубстратный мицелий винно-красный, карминный, воздушный мицелий розовый, светло-винно-красный, местами абрикосово-желтый. На обратной стороне колонии темно-красные.Культуральные и биохимические свойства. На сусло-агаре, среде Чапека-Дохса, Сабуро, мальц-агаре, картофельном и картофельно-глюкозном20,0 8,00,2О, 025 агаре культура Гцэаг 1 цв дгав 1 пеагцвштамм ИМВ-Г Р 1060 растет хорошо,воздушный мицелий и спороносный слоИобильный.В качестве единственного источника углерода предлагаемый штамм использует галактозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, 1. - арабиноэу, 1. - Рамнозу, лактозу, сахарозу, мальтоэу,раффиноэу. Усваивает нитратный и аммонийный азот, однако лучшим источником азота является мочевина. На известной полусинтетической среде приглубинном способе выращивания синтезирует внеклеточную галактозооксидазу. Активность культуральной жидкости на 72-ом часу выращивания 5-6 ед/йл.Для повышения активности культуральной жидкости штамм Гца г 1 цв д гав 1 пеагцв ИМВ-Г Р 1060 выращивают на 20 среде следующего состава, г/л воды:Галактоза 15 - 20Фосфат калияоднозамещенный 7 - 9Фосфат натрия2 двузамещенный б - 8Сульфат магния 0,2 - 0,4Сульфат меди 0,025 - .0,05Мочевина 5 - 10Дрожжевой экстЗО рактРН среды 6,8 - 7,0.Способ получения галактозооксидазы состоит из двух стадий.Стадия 1. Выращивание вегетативйого инокулума.Предлагаемую среду засевают маточной культурой Гцэаг 1 цв дгав 1 пеагцв штамм ИМВ-Г Р 1060, выращеннойна суслс-агаре. Выращивание инокулума производят на качалке с 200 40 220 об/мин 24-28 ч при 28 С+ 1 дС.Стадия 2. Биосинтез галактозооксидазы.В колбы, содержащие среду тогоже состава, вносят 1-2 инокулума к 4 обьему среды. Ферментацию ведут накачалках с 200-220 об/мин при 28 С++1 ОС 72-80 ч. Активность культуральной жидкости к.окончанию ферментации 15-25 ед/мл, в течение следующих24-40 ч активность остается стабильной, а затем медленно снижается.Выделяют галактоэооксидазу изкультуральной жидкости известным способом.П р и м е р 1. Выращивание инокулума штамма Гцэаг 1 цв дгав 1 пеагцвИМВ-Г Р 1060 производят в колбах емкостью 500 мл с 250 мл среды, содержащей, г/л воды:Галактоза60 Фосфат калия однозамещенный 9,0Фосфат натрия двузамещенныйСульфат магния65 Сульфат медиЗаказ 10898/44 Тираж 531 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Мочевина 5,0Дрожжевой экстракт 2,0РН среды 6,8 - 7,0.Среду стерилизуют при 125 С 30 мин. Отдельно готовят и стерилизуют раст воры галактоэы и сульфата меди, которые вносят стерильно в колбы перед посевом. Засевают колбы вегетативным мицелием культуры Гц ваг 1 це дгаа 1 пеагца штамм ИМВ-Г Р 1060, выращенной в течение семи суток на сусло-агаре. Выращивание инокулума ведут на качалке с 200-220 об/мин 28 ч при 28 С. Посевной материал в количестве 1 к объемУ сРеды вносЯт в феРментационные 1 э колбы емкостью 500 мл с 250 мл среды того же состава. Ферментацию ведут при 28 С на качалке с 220 об/мино80 ч. Активность культуральной жидкости к концу ферментации 15 ед/мл.Активность галактозооксидазы из меряют пероксидазо-хромогенным методом. Принцип метода состоит в том, что образующаяся при ферментативном окислении галактозы перекись водорода при участии пероксидаэы окисляет 25 хромогенный акцептор кислорода (одианизидин), оптическую плотность которого измеряют при длине волны 420 нм. За единицу активности фермента принимают то его количество, кото рое вызывает изменение оптической плотности на одну единицу при длине волны 420 нм в 1-сантиметровых кюветах в течение 10 мин в условиях опыта. 35Выделение галактозооксидазы иэ культуральной жидкости осуществляют известным способом.П р и м е р 2. Выращивание инокулума Гцваг 1 ца дгаа 1 пеагцщ ИМВ-Г М 1060 ведут на среде следующего состава, г/л воды:Галактоза 20,0Фосфат калия одно. -замещенный 9,0Фосфат натрия двузамещенный 8,0Сульфат магния 0,2Сульфат меди 0,025Мочевина 10,0Дрожжевой экстракт 3,0 при рН среды 6,8 - 7,0 в условиях примера 1. Ферментацию проводят на среде того же состава в условиях при мера 1. Активность культуральной жидкости на 80 ч ферментации 25 ед/мп.Активность ферментного препарата стабильна в течение 1,5 лет при 4 С.Препарат может быть использован для разработки ферментативного метода определения галактоэы.Полученный предложенным способом препарат галактоэооксидазы обладает высокой специфичностью, катализируя окисление только галактоэы, ее производных, а также олиго- и полисахаридов, в составкоторых входит галак" тоза (о- и 1 в -метил-Д-галактозиды, Д-галактозамин, Й - ацетилгалактозамин, галактоэо-фосфат, УДФ-галактоза, лактоэа, раффиноза). Препарат галактозооксидазы-не.содержит примесей других ферментов - каталазы, пе- роксидазы, галактоэодегидрогеназы, могущих влиять на скорость галактозооксидазной реакции. Способ получения галактозооксидаэы, предусматривающий культивирование продуцирующего фермент микроорга-низма на питательной среде, содержащей источники углерода, .азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации с последующимвыделением фермента из культуральнойжндкости, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью получения целевого продукта без примесей каталазы,пероксидаэы и галактозодегидрогеназыи улучшения таким образом качествапродукта, в качестве продуцирующегомикроорганизма используют штамм Гцва г 1 цв дгаа 1 пеа гцв ИМВ-Г Р 1060.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент США М 3701715,кл. С 12 О 13/10, опублик. 1972.2, С,Ач 1 дад, О,Ааа га 1, С .Авеп в 1 о,В.,НогесЕег. ТЬе д-да 1 асйове ох 1- ба ве оГ Ро 1 урогцв с 1 гс 1 пасцв.,1.В 1 о 1.СЬеа, 1962, 237, Р 9, 2736-2743