Способ получения мутантов дрожжей, дефецитных по цитохромам и содержащих цианидрезистентную оксидазу

Союз Соеетских Социалистических Республик(43) Опубликоваяо 30,03.80. Бюллетень12 СССР по делам иэобретеиий и открытий5) Дата опубликования описания 30.03.80К. Акименк охимии,и физиологии микроорганиз АН СССР нстит 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ДРОЖЖЕЙ,ЕФИЦИТНЫХ ПО, ЦИТОХРОМАМ И СОДЕРЖАЩИХЦИАНИДРЕЗИСТЕНТНУЮ ОКСИДАЗУ ческоиспособ,тагена зчевина,ругие)лотныеисточ-ийхло- з 0 Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам отбора цитохромдефицитных мутантов дрожжей, об.разующих цианидрезистентную оксидазу(Епдотусорз 1 з, СапдЫа, Кодо 1 огц 1 а, Тогц1 орз 1 з, Епдошусез) и может быть использовано в научных биологических исследованиях, в частности при изучении природыцианидрезистентной оксйдазы митохондрийдрожжей и физиологической роли цианидрезистентного дыхания для микроорганизмов.Известны способы отбора цитохромдефицйтных мутантов дрожжей путем получения реплик на плотной среде, содержащей несбраживаемый источник углерода,например этанол, ацетат 11, Однако отсутствие роста колонии может быть обусловлено отсутствием соответствующей депидрогеназы или другого фермента, участвующего в метаболизме этих веществ, но не цитохромов,Наиболее близким по своей технисущности к заявленному являетсясогласно которому обработанную муми (ультрафиолет, нитрозометилмонитрозогуанидин, аюрифлавин и дкультуру дрожжей рассевают на псреды, содержащие сбраживаемыеники углерода и трифенилтетразол рнд, н отбирают бесцветные, неокрашенные формазаном колойии 2.Такие способы отбора цитохромдефицитных мутантов дрожжей не дают однозначных результатов, поскольку в случае пересева культуры дрожжей, обработанной мутагенамЫ, на плотные среды, содержащие сбраживаемый источник углерода и трифенилтетразолийхлорид, получают колонии с разной степенью окраски от красной до полностью бесцветной, причем на развитие окраски сказываются не только мутацион. ные изменения в культуре дрожжей, но и ингибирующее действие трифенилтетразолийхлорида на цитохромоксидазу,В связи с вышеизложенным оба имеющиеся способа отбора цитохромдефицитных мутантов дрожжей обладают недостаточной точностью и специфичностью.Целью изобретения является повышение точности,и специфичности способа.Поставленная цель достигается тем, что из образовавшихся при рассеве на твердой питательной среде колоний микроорганизмов отбирают петитные варианты и выращивают их на жидкой среде со сбраживаемым источииком углерода, а отбор мутантов осуществляют по признаку подавления дыхания после добавления ингибитора циа724575 30 25 401 45 50 60 Изд.193 Тираж 522 Подписное Заказ 109/179 11 ПО Поиск Тип, Харьк. фил, пред. Патент 3Ънидрезистентной оксидазы к суспензии микроорганизмов.Сущность изобретения состоит в том, чтокультуру дрожжей, способную к образованию цианидрезистентной оксидазы (Епс 1 огпусея, Сап д Ыа, 1 сйос 1 о 1 огца, Тогц 1 оря 1 я,Епс 1 отусоря 1 я) обрабатывают мутагенами,например акрифлавином, этидиумбромидом, ультрафиолетовым облучением и рас севают на плотную среду, содержащуюсбраживаемый источник углерода. Через40 - 48 ч отбирают петитные колонии и пере- .севают на жидкую среду, содержащую также сбраживаемый источник углерода. Через10 ч роста проводят полярографическоеизмерение дыхания в присутствиси ингиби-.тора цианидрезистентной оксидазы, например салицилгидроксамовой кислоты, бензгидроксамовой кислоты или ихгалоидпроизводных. Так как цианидрезистентная оксидаза - единственная оксидаза митохондрий у этих цитохромдефицитных дрожжей,культура дрожжей, у которой вэтих условиях полностью отсутствует дыхание, является мутантом, дефицитным по одномуили нескольким цитохромам.Изобретение отличается от существующих способов .отбора цитохромдефицитныхмутантов дрожжей тем, что используютсяспецифические ингибиторы "цианидрезистентной оксидазы на стадии измерения дыхания культур петитных колоний.П р и м е р. Односуточную культурудрожжей Сапс 1 Ыа рагаря 11 оя 1 я выращеннуюс на косяке с сусло-агаром, смывают 5 ллстерильной дистиллированной воды и вносят в колбу объемом 750 мл, содержащую100 м,г среды Ридер с 0,2% дрожжевогоэкстракта и 1% глюкозы. Дрожжи выра-.щиваютна качалке (200 об/мин) при 28 Сдо ранней стационарной фазы роста, Полученную культуру дрожжей засевают по 5 млв колбу с той же средой и вносят стерильный раствор акрифлавина (500, 600, 700,800, 900, 1000 мг/мл),Дрожжи выращивают в течение суток иполученную биомассу из каждой колбыразводят стерильной водопроводйой водойв 10, 100, 1000, 10 000, 100 000,раз. Отбираютиз каждого разведения по 0,05 мл и рассевают на чашки Петри с агаризованнойсредой следующего состава, г/л: Мд 5040.,5 НО 7, (ИН 4),504 1,5, КНрРО 4 1,0;пептон 1,8; дрожжевой экстракт 2,0; глюкоза 10, агар 20.Чашки помещают в термастат на двоесуток при 28 С и через двое суток каждуюпетитную колонию петлей переносят на косяк с сусло-агаром, В одном опыте можноотобрать до 300 петитных колоний. Через сутки часть культуры дрожжейс косяка засевают в колбу с жидкой средойи через 10 ч измеряют степень торможениядыхания культуры дрожжей бензгидроксамовой кислотой. Для этого в полярографи-,ческую ячейку вносят 1,5 мл среды, содержащей 10 мМ трис-фосфатного буфера(рН 5,5) и О,б лл культуры дрожжей, взятых непосредственно из колбы. 100%-ноеподавление дыхания 5 - 10 мМ бензгидроксамовой кислотой указывает, что мутантлишен цитохромов,Среди отобранных петитных колоний(около 300 штук) со 100%-ньгм торможе 15 пнем дыхания бензгидроксамовой кислотойвыявлено 2 мутанта; 25 культур обладаличастичной чувствительностью к бензгидроксамовой кислоте. Дыхание остальных мутантов не подавлялось бензгидроксамовой20 кислотой.В настоящее время получение цитохромдефицитных мутантов представляет большой интерес как один из подходов к изучению природы и физиологической роли циа 25 нидрезистентной оксидазы для микроорга низмов, поскольку природа цианидрезистентной оксидазы митохондрий дрожжейнеизвестна. Формула изобретения Способ получения мутантов дрожжей, дефицитных по цитохромам и содержащих цианидрезистентную оксидазу; предусматривающий обработку исходной дрожжевой культуры мутагенами, ее рассев на твердую питательную среду, содержащую сбраживаемый источник углерода, и последующий отбор, отлич а ющ,и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, из образовавшихся на твердой питательной среде колоний микроорганизмов отбирают петитные варианты и выращивают их на жидкой среде со сбраживаемым источником углерода, а отбор мутантов осуществляют по признаку подавления дыхания после добавления к суспензии, микроорганизмов ин гибитора цианидрезистентной оксидазы Источники информации, принятые вовниманиепри экспертизе; 1, О. 1.1 оус 1. ТЬе пн 1 осЬопс 1 г 1 а.о 1 гп 1 сго- "огра п 1 ягпя. - Аса с 1 егп 1 с, Ргеяя, 1974,55 рр, 285 - 367. 2. М, Одцг, 1 с. Я. Тороп, Я. Иада 1, Те 1 гако 1 ц сп оег 1 ау 1 есЬп 1 с 1 це 1 ог рорц 1 а 11 оп я 1 цс 11 ея о 1 геяр 1 га 11 оп с 1 е 11 с 1 епсу 1 п д 1 ая 1. - Яс 1 епсе, 1957, со 1, 125, рр, 928 - 929,