Способ культивирования

ОП ИСАНИ ЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАвЕН 1 У Союз СоветскихСоциапистицескихРеспублик(32) 31.10.6 (33) Япония Государственный иамитет Совете Министров СССР ао делам изобретений и открытий(Япония) кихнро Ямамото странная фирмасики Канша и Кийова Хакко Коги(Япония 54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЗТЯЕРТОСОССОЯ НЕМО 1.УТС бакте время этого темпе. 61) Дополнительный к пат Изобретение относится к микробиологии икасается получения клеток гемолитического стрептококка с высокой противоопухолевой активностью.Известен способ культивирования Ятгерто.соссцв певоуОсцв на питательной среде, содержа. 6щей экстракт бычьего сердца, пелтон, хлористыйнатрий, нукленнат натрия, фосфат натрия, бикарбонат натрия, ацид натрия, хлористый литий рибофлавин, уксуснокнслый таллий, дефибрннированнуюкровь и мальтозу с последующим отделением кле. 10ток от среды 11) . Однако известный способ необеспечивает высокой противоопухолевой активности культуры.Целью изобретения является повышение про.тивоопухолевой активности культуры. ИЭта цель достигается тем, что штамм Зтгер.тососсцв пепе убсцв АТСС 21060 выращивают насреде, содержащей 3,0 - 6,0% дрожжевого экстрак.та, при рН 7,0 - 7,4,Среду, которую используют для выращивания 20культуры, получают путем растворения, напримерэкстракта дрожжей или автолизата дрожжей в воде,нагревания раствора после нейтрализации и последующей фильтрации для отделения нерастворимойфракции, рН среды 7,0 - 7,4, концентрация дрожже 25 вого экстракта 3,0 - 6,0%, Могут быль использованытакже пептоны. или экстракты (рыбные или мяс.ные из говядины, конского или китового мяса)В качестве неорганических солей можно использовать, например хлористый натрий, первичный фосфат натрия или бикарбонат натрия, Хорошие резуль.таты получают при добавке рибонуклеиновой кислоты или рибонуклеазы. Посев бактерий производятпутем добавки к среде бактериалыых клеток,подвергнутых предварительному выращиванию притемпературе 30 - 40 С, преимущественно при 37 С.В качестве среды для предварительного выращива.ния используют дрожжевой экстракт. В том случае, когда для получения культуры используютдрожжевой экстракт, противоопухолевая активностьриальных клеток, которая увеличивается вовыращивания, несколько снижается по мереудлинения этого времени. Если для предварительного выращивания используют мясную воду, тодопустимое время для выращивания бактерийувеличивается, лучше использовать для ратуру 37 С и время 12 - 30 ч.Можно использовать и другие среды, напри.мер состоящие из мясного экстракта, пептона ихлористого натрия. Пбсле завершения выращиванияСоставитель С. Малютина Техред М. Лев ицкая Коррскор С, Шекьар Редактор Н. Потапова Заказ 2943/49 Тираж 568 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР пе делам изобретений и открытий 113035, Москва, )К - 35, Рауйсская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент" г. Ужгород ул. Проектная, 4 культуры бульон охлаждают и бактериальные клетки вьщеляют путем центрифугировмия,Полученные клетки гемолитицеского стрепто.кокка применяют для общего лечения после уничтожения вирулентности этих клеток и способностиих продуцировать гемолизин путем дробной термообработки при ЗО - 38 С в течение 10 - 30 мин изатем при 40-45 С в течение 20 - 40 мин и любойподходящей среде с содержанием, например пеници)шина или основной среды Бернгеймера, состоящей 10изб мл раствора с содержанием 67,5 мг мальтозы и 20 о-ного водного раствора монокалийфосфата устанавливают рН 6,9 - 7,0 едким натром, 12 мп2%-ного водного раствора семиводного сернокислого магния и бб мл дистиллированной воды. 5П р и м е р 1. Приготовление среды иэ мясной воды,50 г говядины, тщательно освобожденные отжира и сухожилий, измельчают и интенсивно встря.хивают после добавки 100 мл дистиллированной 20воды. Затем смесь оставляют на ночь в холодильнике, на следующие сутки ее нагревают при 100 Св течение 1,5 ч. Для получения необходимой средыее фильтруют после охлаждения, к 100 мл этойсреды добавляют 1 г пептона и 0,5 г хлористого 25натрия, кипятят 30 мин при 100 С и регулируютрН путем повторного нагревания при 100 С в течение 30 мин, при необходимости регулируют рН.После этого фильтруют смесь через фильтровальнуюбумагу, наливают в несколько пробирок по 10 мп 30в каждую и стерилизуют паром под давлением1 кг/см в течение 10 мин.П р и м е р 2. Приготовление среды издрожжевого экстракта. 9 г дрожжевого экстрактарастворяют в 200 мл дистиллированной воды, уста. З 5навливают рН 7,0 - 7,2 10%.ным водным растворомедкого натра и нагревают 60 мин при 100 С, Выпавший осадок отфильтровывают и вновь регулируют рН фильтрата 10%-ным раствором едкого натрас последующим нагреванием при 100 С в течение 4030 мин и фильтрацией. К полученному фильтратудобавляют воду до конечного объема 300 мл, разливают по колбам и стерилизуют паром нод давлением 1 кг/ем,Далее йсходят из запасной культуры гемолити 45ческого стрептококка (штамм. Бт. АТСС 21060) вмясной воде, которой инокулируют 10 мл мяснойводы и выращивают в течение 24 ч при 37 С. Предкультуральный бульон используют для инокуляции50 ЗОО мл выше указанной среды и выращивают ее в течение 20 ч при 37 С. Клетки гемолитического стрептококка с высокой противоопухолевой актив. ностью получают путем последующего охлаждения культурального бульона льдом, центрифугирования и двухкратной промывки бактериальных клеток физиологическим раствором.Запасную культуру гемолитического стрептококка 1 штамм Зт. АТСС 21060) используют для инокулирования 10 мл дрожжевого экстракта аналогично примеру 1. После этого выращивают бакте. риальную культуру в течение 24 ч при 37 С. Этот предкультуральный бульон служит для инокулирования 300 мл дрожжевого экстракта, который выращивают беэ перемешивания в течение 14 ч при 37 С. Бульон охлаждают затем льдом и центрифугируют. Путем промывки полученных бактериальных клеток физиологическим раствором получают клетки с высокой противоопухолевой активностью,П р и м е р 3. Готовят 300 мл культураль. ной среды из 15 мл дрожжевого экстракта и 10 мл предварительной культуральной среды. Для этой цели используют 0,5 г экстракта по примеру 1. При предварительном и последующем выращивании с применением запасной культуры (штамма Зц. АТСС 21060) в мясной воде с последующей обработкой культурального бульона получают бактериаль ные клетки с высокой противоопухолевой актив. ностью.Испытания на противоопухолевую активность показали, что полученная культура обладает высокой противоопухолевой активностью на едикп 1 у веса гемолитического стрептококка. Формула изобретения Способ культивирования Ятгертососсцв Ьеп)о 1 уьоцв на среде, содержащей источники углерода,азота и минеральные соли, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения .прохявоопухолевой активности культуры, штамм ЗтгертососсцвЬето 1 ут 1 сцв АТСС 21060 выращивают на среде, содержащей З,О - 6,0% дрожжевого экстракта, при рН 7,07,4,Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе:1, Многотомное руководство по микробиологии т.1, 1962, с.312-321.