Способ подсчета лейкоцитов

ОП ИКАНИЕИЗОБРЕТЕ Н ИЯК ПА 7 ЕН 7 У Союз Советекии Социалистических Республик(31) 85333 осударатвеннын комитетСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий(43) Опублик (45) Дата оп тень2 эЗ) УДК 611 018. 5 ( 088 ликования описания И. 0 з.7 8 72) Авторы изобретения Иностранцы,Гудсон Р. Анслей и Леонард Орнстей (США) Иностранная фирмаоунт Синай Рисерч Фаундэйшн (США) Заявите 54) СПОСОБ ПОДСЧ ЕИКОЦИТО области медицидиагностическойержання лейкоци ктике для о еления в кров одсчета лейкоцитного окрашивания Известен спософиксации, фермента иза 11). путем ем Однако известныи способ не обеспечиваетференциального подсчета лейкоцитов от другименных элементов крови. яется дифференциальдругих форменных 1 с помощью фотометЦелью изо тения ов о ыи подсчет лен приме элементов крови,Эта цель дос тигается тем, что ф т моноальдегидом последу мическ и крови прощим гемолизом им. 21 юашиванн хромогеннне образует буферной ревом пол - 10 мин. м сопрягавнеклеточнмеси для субстратом, смешащим реагентом, ко макрочастиц, доба регулирования рНот 20 до 55 С в т ным орь вление и под ечение ннои смеси Изобретение относитси может быть использован Кроме того, при окрашивании нейтрофилов и эозинофилов, в качестве цитохимического окрашивающего субстрата используют перекись, а хромотенного сопрягающего реагента - 4. хлор- -нафтал, а для окрашивания моноцитов в качестве цитохимического окрашивающего субстрата используют альфа.нафтилбутират, а хромогенного сопря. гающего р. агента - гексазоний - парароэанилин.Способ осуществляют следующим образом,Добавляют цитологический фиксирующий реак. тив к раствору, содержащему белые кровяные клетки (например, цельную кровь) для умерщвления со. держащихся там кровяных клеток и иммобилизации содержащихся з клетках каталитических энзимов, Предпочтительными являются пробы жидкости организма, такие. как цельная кровь и спинномозговая жидкость. После добавки фиксирующего реактива раствор обрабатывают особым цитохими-. ческнм веществом, хромогенными осаждающим копулирующим реактивом и буфером.Цитологический фиксирующий раствор представлчет собой преимущественно 0,2 - 40%-ный водный раствор моноальдегида, такого как фор. мальдегид, бутиральдегид, пропиональдегид и апет альдегид. Лиальлегиды непригодны, так как обуслов.5 1 О 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 60 ливают сетчатую структуру и вызывают внеклеточ ные осаждения.Концентрация моноальдегида должна быть достаточно высока для умерщвления клеток, однако, беэ нарушения активности энзим.Низкие концентрации при низких температу. рах требуют дополнительного времени. Так, напри. мер, при концентрации формальдегида в растворе равной 2%, при 4 С требуется 12 ч, а при 4%.ной концентрации при 50 С требуется 2 мин.Так как обычно смешивают равные объемы жидкости организма и раствора моноальдегида, крепость альдегидного раствора является двойной по сравнению с концентрацией во время фиксации альдегида в растворе.Предпочтительным является 37% ный раствор формальдегида.Когда жидкость организма, содержащая лей. коциты, представляет собой цельную кровь, то не. обходимо осуществить гемолиз лейкоцитов, так как существует опасность, что совпадающее прохождение двух или большего количества красных клеток через фотометрическую счетную станцию ошибочно может быть принято как окрашенные лейкоциты или ненормальные клетки. Для этого осуществляют гемолиз красных кровяных клеток путем добавления реагента к суспензии клеток, чтобы обусловить разрыв только красных клеток и выделение их содержимого (например, гемогло. бина) в,раствор.Гемолиризующие реагенты не должны свер. тывать взвешенные клетки и не должны мешать протеканию любых последующих гистохимических реакций путем, например, взаимодействия с какими-либо соединениями, используемыми для окрашивания клеток на последних этапах.Гемолиз проводят либо до, либо после окра. шивания. Если гемолиз проводят после окрашивания, то это не должно существенно изменять ок. раску или изменять окрашенные или неокрашенные лейкоциты.Гемолиз проводят введением в раствор, содер. жащий красные и белые кровяные клетки, водного раствора алифатической кислоты с величиной рН ,3,0 - 5,5. Удовлетворительные результаты дает при. менение уксусной, пропноновой, масляной и молочной кислот в концентрации 1 - 10%.Предпочтительным является раствор уксусной кислоты концентрации около 7%, Раствор может быть нагрет до температур, начиная от 40 (в тече. ние 8 мин) до 55 С (в течение 1 мнн), чем достигается инактнвация энэима катализы, снижение псевдопероксидазной активности гемоглобина и ускорение гемолиэа. При более низких температурах для реакции требуется больше времени. Использование еще более высоких температур инактивирует энзимы пероксидаэы и ускоряет свертывание после введения гемолиэирующего реагента.Окрашивание клеток требует тщательного вы-бора реактивов. Используют большое количество известных цитохимических субстратов. Так для ок. рашивания клеток, содержащих пероксидазу, таких как эозинофилы или нейтрофилы, применяют смесь неорганической или органической перекиси и 4- хлоро.1-нафтала. Перекись и 4.хлоро.,1.нафтал слу. жат в качестве энзимных субстратов, а 4-хлоро-нафтал служит также в качестве копулирующего реагента, 4.Хлоро-нафтал производит темно-синее окрашивание внутри содержащей пероксидазу клетки без введения отдельного хромогенного осаждаю. щего копулирующего реактива. Можно также ис. пользовать смесь о-толидина и 4-хлоро-нафтала для получения пурпурно красного красителя, если используемый на ступени фиксирования формаль. ресид инактивирован.Для избирательного окрашивания контролируют рН раствора. Если рН раствора ниже 3,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в зозинофилах. Если рН раствора находится в пределах 3,0 - 5,0, то тяжелые осадки красителя образу. ются только в нейтрофилах, Если рН находится в пределах 5,0 - 7,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в эозинофилах и нейтрофилах. Если окрашивают липаэосодержащие клетки, т,е. моноциты, то используют комбинации сложно. го эфира, нафтола, такого как 1 нафтилацетата или 1-нафтилбутирата и диамониевой соли, например, гексазоний - парароэанилин, который является хромогенным осаждающим копулирующим реагентом; рН для этой реакции окрашивания 5,5- 6,5, предпочтительно около 6,0, при такой рН тя. желые осадки красителей образуются только в моноцитах.С целью адекватного цветного окрашивания в моноцитах за короткий отрезок времени, напри. мер за 5 мин концентрация субстрата должна пре. вышать примерно 0,5 мг/мл в окончательном ин. кубационном растворе. Сложные эфиры нафтал- -АБ и их производные и 1.нафтилбутират менее растворимы, чем 0,5 мг/мл, поэтому в них вводят 2,2-оксидиэтанол (диэтиленгликоль) или другие водные спирты или эфиры, например этиленгликоль, пропиленгликоль, диметиловый эфир этиленгликоля и диэтилкарбитоля. После этого 1.нафтилбутират и 1.нафтилаце. тат могут быть растворены в концентрациях до 1 мг/мл. Могут быть растворены также и другие субстраты, такие как нафтнлхлорацетат, сложные индоксильные эфиры, такие как сложные эфиры индоксилацетата, индоксилпропионата и индоксилбутирата, сложные эфиры З-оксихинолина, такие как 8-оксихинолинацетат, 7. оксихинолиниропионат и 8-оксихинолинбутират. При тех же условиях бу. дет растворено только около 0,1 мг/мл нафтал- -АЬ.ацетата, что приводит к значительно более слабому выявлению цветного окрашивания. Дру. гие сложные эфиры производных нафтал.АБ рас. творяются даже в меньшей степени.8 15 Растворы перекиси водорода используют всоединении с упомянутыми растворами 4.хлороиафтола. Можно использовать большое количествдругих органических и неорганических перекисей,например перборат.тетрагидрат натрия, перекиськарбоната натрия, перекись пирофосфата натрия,этилгидроперекнсь, третичная бутилгидроперекисьи перекись мочевины, Все они применяются в ко.печных концентрациях 0,1 - 0,001% от веса конечнойконцентрации. 4-Хлоро.нафтол используют в ко.печных концентрациях от 0,001 до 0,06 вес.%:Реагенты моноцитовОсновные растворы:2-Нафтилбутират - 1 вес.% в 2,2.оксидиэтаноле;1,15 М КНгРОа (двухосновный) 9,07 г/л;1,15 М КгНРО (двухосновный) около 11,61 г/л;Основной фуксин (например, УаФеаоп, Соеваи апд Ве) 1 г в 25 мп 2 НО;2,2-0 ксидиэтанол;0 1 М КгНР 041 г азотистокислого натрия в 25 мл воды.Рабочие реагенты, мл:. а - Нафтилбутирата. Нафтилбутнрат (основнойраствор) 2,02,2-Ок сиди этанол 6,01,15 М КНг РО (одноосновный) 8,0Этот раствор должен готовиться ежедневно.Количество основного фуксина используют вконечной концентрации 0,00 - 0,01%,55Для окрашивания моноцитов добавляют примерно. 0,32 мл/мин фиксированной формалиномпробы а-нафтилбутирата и около 0,42 мл/мингексазоний иарарозанилнна, для окраски эозинофи.лов добавляют 0,60 мл/мин красящего раствора ьои около 0,10 мл/мин 0,06 н, перекиси водорода,Предпочтительны реагирующие вещества, которые могут использоваться для окрашивания моноцитов, эозинофилов и нейтрофилов:Эозинофило.нейтрофильные реагенты.Основные растворы:50,003 и 0,006 вес.ч, перекиси водорода в воде;0,05 г 4-хлоро-нафтала в 25 мл 2,2.оксидиэтанол.," 0,42 мл/мин фиксированной формалином гемо. лизированной пробы.Как пероксидазному; так и моноцитному окрв. шиваиию мешают многие компоненты.Когда происходит пероксидазная реакция, сыворотка каталазы может подавлять пероксидазу гранулоцитов и тем самым истощать субстрат, Каталаэа является лабильной в отношении нагрева при 50 С, в то время как пероксидаза устойчива до температуры 80 С. Нагрев от 40 (в течение 8 мин) до 55 С (в течение 1 мин) или при других подходящих температурах и в соответствующие отрезки времени на ступени фиксации формалином или после того инактивирует катализу, Предпочтительное время нагрева прн 50 Смнн. Разбавление крови в дальнейшем усиливает соотношение внутриклеточной пероксидазнок активности до остаточной концентрации каталазы.Нагрев раствора крови также разрушает псев. допероксидаэную активность гемоглобина.Препятствующим компонентом в ходе окра шивання моноцитов является ингибитор С 1-эстера. зы, являющийся компонентом сыворотки, полдерФживающий инактивность С 1-зстеразы. Действие ингибитора С 1.эстераэы может быть блокировано различными способами, например добавлением к пробе смеси гепарина, разбавлением образца калиевой солью, нормально требуется 50 кратное раэ. бавление. Предпочтительным является добавление 2,2-окснднэтанола к фиксированной пробе крови в концентрациях 10 - 30%.Предлагаемый способ обеспечивает более быстрый дифференциальный подсчет лейкоцитов на большом количестве клеток.Формула изобретения1. Способ подсчета лейкоцитов путем фикса ции, ферментативного окрашивания и гемолиэа, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью дифференциального подсчета лейкоцитов от других фор. менных элементов крови, например, с помощью фотометрии, фиксацию цельной крови проводят моноальдегидом, с последующим гемолизом и ок. рашиванием цитохимнческим субстратом, смешан. ным с хромогенным сопрягающим реагентом, который не образует внеклеточных макрочастиц, добавлением буферной смеси и подогревом полу. ченной смеси от 20 до 55 С в течение 1 - 10 мин.2. Способ по п., о т л и ч а ю щ и й с я тем, что лрн окрашивании нейтрофилов. и эозинофилов в качестве цитохимичсского окрашивающего субстрата используют перекись, а хромогенного сопря. гаюшего реагента 4-хлор-нафтол.3. Способ по п 1, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что для окрашивания моноцитов в качестве цитохимического окрашиваюцего субстрата исполь. зуют альфа-нафтилбутират, а хромогенного сопря. гаюшего реагента - гексазоний -парарозанилина.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1, Ромейе Б. Микроскопическая техника 1953, с. 314-329.