Способ получения токсина

) Заявлено 20.04.76 Р 6/13 аявкн рисоединен Гасударственная комитетЙаата Мнннстрса 6 Кв деми нзобретвннйн еткрмтрй54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКС Изобретение относится к микробиологии,а именно к культивированию патогенныхмикроорганизмов, которые найдут применение при производстве анатоксинных препаратов, используемых в медицине, бИзвестен способ получения токсина путемпредварительного выращивания инокулюматоксинообразуюших микроорганизмов с последующим культивированием при непрерывнойподаче питательной среды 19Недостатком известного способа является то, что в течение переходного (от перисдического к непрерывному) режима наблюдается вымывание активной части токсина,что снижает его выход. 15Цепью изобретения является ловывыхода токсина,шение среду и удел и удел ов 2:1 уюшим ной ьной ра й матеработ С этой цепью питательную нают подавать при соотно 1 чен скорости образования токсина скорости роста микроорганизм Способ осуществляют следом, Сначала подготавливают лосеИсходным посевным материалом служит культура Ссоьтйиш реттпрм тина А (штамм28 ВР 6 К), хранившаяся в пробирках на среде Китт-Тороцци с мясным фаршем под споем вазелинового масла иа холоду. Эту культуру засевают в количестве 1%,в 200 мл регенерированной казеиново-панкреат ческой среды с пшеном и ватой во флаконы, в которые добавляют 1% глюкозы и помешают на 6-18 час в термостат при37" С.После этого из флакона стерильно берут пробу культуры и разводят ее в стерильном физиологическом растворе 1;100 дпя подсчета выросших бактерий. Наилучшим посевным материалом считают тот, в котором клетки имеют вид коротких палочек одинаковой формы, а концентрация бактерий составляет 2,0-2,510 а клеток (в мп).Полученную бактериальную культуру используют в качестве посевного материала ин окулюма) для и оследуюшего пр одесса предварительного периодического выращивания. С этой цепью подготавливают к работе установку, подогревают в ферментере питательную среду до 37 С н вносятпосевной материап в количестве 2% (30 м, на 1,6 и казэиново-панкреатической питатепьной среды без пшена и веты.).Перед работой в бутыпи с питатепьной средой стерильно добавпяют 1% гпюкозы. 5 Бутыпь помещают на установку и стерипь. йо соединяют с сифоном дпя подачи питатепьной среды в ферментер.Вкпючают систему записи оптической плотности, учета гаэообраэования и регист рации рН. Начапо роста купьтуры опредепяют по снижению величины рН, начапу газообразования, возрастанию степени мут- ности купьтуры и увепичению концентрации бактерий. 15Концентрацию бактерий и активность токсина опредепяют в пробах, взятых в процессе предваритепьного купьтивирования с интервалами 0,5-1 час. Поспеднююпробу берут в момент снижений гвзообразования 20 и прекращения роста купьтуры.Концентрацию бактерий опредепяют в камере Горяева. В ряд пробирок разпивапи по 4,5 мп физиоцогического раствора. В каждую пробирку вносят 0,5 мп предвари тельно перемешанной купьтуры на определенном этапе развиты. На рабочий участок камерыппотно притирают покровное стекпо. Купьтуру в разведении 1:100 вносят под покровное стекпо так, чтобы под ним не . 30 оказапось воздушных пузырьков. Подсчет ведут с помощью, микроскопа при увеличении в 280 раз в 1 бб мапых квадратах камеры. Копичество кпеток, попученных поспе подсчета, пересчитывают на 1 мп 35 куньтуры. Расчет проводят по формупе:Каки юфгде М -чиспо бактерий на 1 мн купьтурыфх - чиспо бактерий в 100 мапьгх кван ратах;П -поправка на разведение,Йпя опредепения активности токсинов получают стерипьные пвнтрифугаты купьтур С 60 йгйцт ВфъефСО 5 из которых де пают ряд разведений 0,9 Ъ-йымраствором, хпористого натрия. Разведенный токсин вводят в вену хвоста бепЪм мышам весом 16-18 г по 0,5 мп. За одну минимальную дозу (1 цмто/нл )принимают наименьшее 50 копичество токсина, способного при внутривенном введении вызывать гибель не менее . 50% взятых дпя опытов бепых мышей в течение 4 суток. За титр токсина принимаютнаибопьшее его разведение, при котором 55 происходит гибель бопее 50% мышей на 4 сутки в пересчете на 1 мп при введении0,5 мп токсина.Поспе завершения контропьного периодического куньтнвирования инокупюма и 60 выбора периода с оптимальным соотношением удепьных скоростей вкпючается одна из систем дозированной непрерыв й подачи питатепьной среды и начинается непрерывное выращивание купьтуры. При этом подачу питатепьной среды производят таким образом, чтобы скорость разбавления быпа равна по абсопютной вепичине удельной скорости роста в избранный период развития пс пупяции. Еспи соотношение удепьных скороотей процесса является оптимальным, то в переходном (от периодического к непрерывному) режиме концентрация токсина не будет снижаться, а останется на постоянном уровне, т. е. повысится выход токсина при непрерывном купьтивировании микрс организмов.Еспи в процессе периодического купьтивирования нет периода, в котором удепьная скоростЬ синтеза токсина в 2-3 раза превышает удепьную скорость роста, спедует подобрать усповия купьтивирования (питатепьная среда, ферментер, аэрацияперемешивание и т. д.) таким образом, чтобы попучить жепаемое соотношение.Резупьтаты непрерывного купьтивирования И 0 тМ(цо 1 ИГ)нфдйгапа А штамма ВР 6 К в лабораторных условиях показывают, что поспе начапа подачи среды в ферментер, в котором выращивается инокупюм, концентрация токсина ( дм ф/ мп) ие снижается и остается при этом высоком уровне в течение поспедующего режима непрерывного купьтивирования.Предпагаемый способ предотвращает вымывание токсина в переходном режиме, обеспечивая высокий выход токсина при непрерывном купьтивировании микроорга- ниэмов. формупа изобретенияСпособ попучения токсина путем предваритепьного выращивания инокупюма токси нообразующих микроорганизмов с поспедующим культивированием при непрерывной подаче,питатепьной среды, о т и ич а ю щ и й с я тем, что, с цепью повышения выхода токсина, питатепьную среду начинают подавать при соотношенииудепьной скорости образования токсина й удепьной скорости роста микроорганизмов 2:1.Источники инфврмвции,принятые во внимание прй: ецсиерФизэ:1. Мерцапов В. М. Непрерывное купьтивирование патогенных анаэробов на мо дени СбоаФлчабооф регутгщепь типаА, (шгамм ВРВК), анд, дисс, М.,1968 г.