Способ определения скорости роста клубеньковых бактерий в почве

Союз Советскмк Социалмстнческик РеспублккОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯХ АВТОРСХОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ нн 88 9702(22) Заявлено 170480 (21) 2913236/30-15с присоединением заявки Мо(51)М. Хл,з С 12 М 1/02 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ РОСТА КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВЕ Изобретение относится к микробио-. логии и касаетсч вопросов, связанных со скоростью роста микроорганизмов в почве,Известен способ определения скорости роста бактерий в естественной (водной) среде обитания на стеклах обрастания. Для определения времени генерации подсчитывается общее количество микроорганизмов на стеклах в начальный момент и через определенное время. Причем в этом способе учитывается, что клетки, образующие колонии, могут вновь прикрепляться к стеклу из среды в течение опыта. Таким образом, этот способ позволяет рассчитывать скорость роста бактерий с учетом того, что не все бактерии, попавшие на стекло, способны размножаться и что во время опыта постоянно идет приток бактерий извне 1 ).Однако способ не применим для почвы, так как в этом случае исключается типичная для воды свободная миграция клеток.Известен также способ определения скорости роста бактерий, например клубеньковых, в почве путем учета морфологических особенностей клеток, при этом исходят из количествдвойных клеток, присутствующих всреде в момент исследования. Долядвойных клеток имеет обратную коррелятивную связь с временем генерации 122Недостатком такого способа является то, что в почве микроорганизмыразвиваются на поверхности твердыхчастиц в виде микроколоний, причеммикроколонии длительно сохраняютсяпосле снижения скорости роста. Поэтому корреляция между временем генерации и процентом двойных клеток в 15 почве в общем случае оказываетсяслабой или несущественной.Цель изобретения - повышение чув,ствительности способа.Поставленная цель достигается 20 тем,что в качестве морфологическихособенностей клеток учитывают их кокковидную форму, при этом в почвузакладывают предметные стекла, инкубируют их, просматривают с помощью 25 иммунолюминесцентной микроскопии ипо доле кокковидных форм от общегочисла клеток определяют скоростьроста бактерий в почве.Сущность изобретения заключается 30 в том, что морфология клеток являет889702 ЗО Формула изобретения Составитель Т,Роденкова Редактор М.Петрова Техред Т.Маточка Корректор, М. ДемчикЗаказ 10898/44 Тираж 531 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "атенг", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 ся индикатором скорости их размножения н почве, что следует из установленного факта о том, что старые культуры клубеньковых бактерий имеют кокковидную Форму, а молодые представлены палочками,П р и м е р. Берут 4 пробы по 80 г почвы-чернозема типичного. Культуры клубеньковых бактерий В Ь 1 гоЬ 1 цв 1 едцапоагца (штаммы Эк и 115) и ВЬ 1 гоЬ 1 цв йг Ио 111 (штаммы Т 37 и 0403) вносят в почвенные пробы в расчете 10 клеток на 1 г почвы (каждый штамм в отдельную пробу). Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60 от общей влагоемкости и насыпают в стерильные чашки Петри по 40 г в каждую. Внутрь почвенного слоя закладывают предметные стекла - по два в каждую чашку, так что для каждого штамма бактерий исследуют йо четыре стекла, Стекла вынимают спустя 2 ч, .3, 7 и 14 суток .после помещения их в чашки .(по одному для каждого штамма в каждый срок).После выемки стекло помещают в стоячую воду на 3 мин, затем вынимают, высушивают и фиксируют. В итоге имеют по 4 стекла для каждого штамма в разные сроки развития популяции клубеньковых бактерий в почве. Затем проводят иммунолюминесцентную окраску стекол, Для каждого штамма используется специфическая кроличья сыворот ка и общая для всех штаммов антикроличья сыворотка (разведения сывороток подбираются предварительно). После проведения стандартной процедуры окрашивания под люминесцентным микроскопом пРосматривают 200 полей зрения на каждом стекле для установления общего количества клубеньковых бактерий каждого штамма и количества кокковидных клеток. Клубеньковые идентиФицируют по наличию ярко-зеленого ободка вокруг клетки при просмотре ее под люминесцентным микроскопом. Далее устанавливают долю кокковидных Форм от общего числа клеток. Время генерации определяют обычным способом, используя данные об общем количестве бактерий в разные сроки наблюдения. В результате проведенного корреляционного анализа для пар "удельная скорость роста - доля кокковидных клеток" устанавливают наличие сильнбй и существенной корреляции для этих величин. Формула корреляции:,О0,016-0,00025, Ъ кокков (ч 1),где ,0- удельная скорость роста.Зная удельную скорость роста, постандартным формулам можно вычислитьвремя генерации клеток клубеньковыхбактерий в почве. Время генерации 0,693 удельная скорость ростаВ дальнейшем при работе с внесенной популяцией клубеньковых бактерийопределяют долю коккОвидных форм отобщего числа клеток и используют полученную формулу (или составленную,гранулировочную шкалу) для определения времени генерации и скорости роста исследуемой популяции в почве.Например, если доля кокков 10 Ъ, тоудельная скорость роста составляет0,0135 ч ", а время генерации 51, 3 ч;20 если доля кокков 20 , то удельнаяскорость роста составляет 0,011 ча время генерации 63 ч. Чем большеколичество кокковидных форм, тем медленнее происходит удвоение бактерий.25 Таким образом, применение способа определения скорости роста клубеньковых бактерий впочве повышаетскорость определения и чувствительности метода. Способ определения скорости ростаклубеньковых бактерий в почве путемучета морфологических особенностейклеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве морфологических особенностей клеток учитывают 40 их кокковидную форму, при этом в почву закладывают предметные стекла, инкубируют их, просматривают с помощью,иммунолюминесцентной микроскопии ипо доле кокковидных форм от общего.45 числа клеток определяют скорость роста бактерий в почве. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 50 1. Иерусалимский Н.Д. Вычислениескорости роста водных микроорганизмов на стеклах обрастания. Микробиология, т,ХХ 1, вып. 5, 1954, с. 561.2. Арр 11 ед апд епч гопеепйая 1 сгоЬ 1 о 1 оду. 1979, ч. 37, 5, р. 805.