Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток животных

(51)5 С 12 К 5/О ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН 2 ов, ов, ве- РУ вв ож- ния ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1161548, кл. С 12 й 5/00, 1985,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения микроносителей для культивирования клетокживотных. Цель изобретения - повышениеадгезивных свойств микроносителя, упрощение процесса культивирования клеток и Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения микро- носителей (М Н) для кул ьти вирования клеток животных с зависимым от прикрепления к твердой подложке ростом.Использование МН для выращивания клеток животных позволяет значительно оптимизировать процессы как получения биомассы самих клеток, так и продукт синтезированных ими, к примеру гормон вирусов и других биологически активных ществ. При этом достигается снижение т доемкости биотехнологических процессо результате того, что появляется возм ность использовать для культивирова клеток ферментационного оборудования, и тем самым становится возможным осущестувеличение выхода клеточной массы, Для этого к 3,5 - 4,00/О-ному раствору желатины добавляют 0,14-0,200 ДЕАЕ-декстрана, 10- кратного раствора Эрла до объемного соотношения 100:(2,6 - 3,0)и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08 - 0,10. После формирования геля его замораживают при ( - 20) - ( - 25)С, затем размораживают, дробят, отмывают и стерилизуют., Частицы микроносителя представляют ячеистую структуру с размером частиц 0,05-2.0 мм и размером ячеек 40 - 80 мкм. По сравнению с прототипом на 14 увеличивается адгеэивность частиц микроносителя, выход клеточной биомассы увеличивается в 1,3 раза. Кроме того использование полученного микроносителя исключает необходимость подбора условий в начальный период культивирования клеток. 1 табл,влять процесс в одном объеме культивационной среды,Наиболее близким к предлагаемомуизобретению является способ полученияжелатиновых МН для культивирования клеток животных, предусматривающих формирование частиц МН путем диспергирования10-250/,-ного раствора желатины, содержащего 1,4 - 1,75% глютарового альдегида, внеполярном органическом растворителе споследующей отмывкой сформированныхчастиц МН и их сепарированием.Однако получаемые в результате известной обработки желатины частицы МН обладают низкими адгезивными свойствами вотношении клеток животных, что значительно усложняет процесс их использования,45 верхности клетками, обрабатывают смесью 50 0,250 -ного раствора трипсина и 0,02-ногораствора Версена, взятых в равных обьемных соотношениях, после чего подсчитывают количество ресуспендированных клеток в камере Горяева, Прикрепление клеток 55 4647 к поверхности МН к пятому часу инкубирования составляет 85,4-867 ь, а прикрепление клеток РАРк этому же сроку инкубирования составляет 87,9-950 , Прирост клеточной массы через 6 сут культивитак как при.этом необходимы подбор режимов посадки клеток, а также требуется специальное оборудование для осуществления начальных этапов культивирования клеток.Целью изобретения является повышение адгезивных свойств МН, увеличение выхода клеток и упрощение процесса культивирования.Для этого в раствор желатины (3,5 - 4,0 ) вносят дополнительно ДЕАЕ-декстран (до 0,14 - 0,20), десятикратный раствор ЭРЛА (в объемных соотношениях 100:(2,6 - 3,0), а для полимеризации желатины в нее добавляют глютаровый альдегид (0,08-0,100 ), Полученную смесь охлаждают до образования геля, а гель замораживают при (-20)-(-25)С, После разморозки геля частиц МН формируют из него путем дробления.В предлагаемом способе на этапе полимеризации желатины органическая фаза заменена на водную с формированием МН с пористой структурой, Предлагаемая в способе совокупность признаков позволяет получить МН с адгезией достаточной для прикрепления клеток животных во взвесях, что обеспечивает равномерное распределение их на поверхности МН и увеличивает выход клеточной массы,Способ осуществляют следующим образом,В 50 мл 3,5-4.0%-ного раствора желатины, приготовленного из пищевой желатиныили 1 сорта, вносят последовательно ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14 - 0,20%, десятикратный раствор ЭРЛА в объемных соотношениях 100:(2,6 - 3,0) и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08-0,10%, причем последний ингредиент добавляют к раствору желатины капельно, тщательно перемешивая. Последнее обстоятельство вызвано тем, что в нагретом до 50 С растворе желатины глютаровый альдегид вызывает неравномерное формирование геля с узелковыми уплотнениями темного цвета. Затем полученную смесь охлаждают до 4 - 20 С и выдерживают ее до образования геля (полимеризация), В последующем гель замораживают при (-20) - ( - 25)ОС. Формирование частиц МН производят путем дробления геля в ножевом гомогенизаторе при скорости вращения вала с ножами 100- 250 об/мин в течение 5-7 мин. По своей форме частицы МН представляют ячеистую структуру с размером частиц 0,05 - 2,0 мм и размером ячеек 40-80 мкм,Частицы МН в последующем отмывают последовательно в дистиллированной воде и физиологическом растворе. Передисполь 5 10 15 20 25 30 35 40 зованием МН стерилиэуют автоклавированием, отмывают раствором Хенкса до достижения рН 72-7.4 с последующим ресуспендированием МН в питательной среде.П р и м е р 1, К 50 мл 3,5-ного раствора желатины добавляют последовательно ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14, десятикратный раствор ЭРЛА в соотношении к объему желатины, равном 100;2,6, и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08%. Полученную смесь выдерживают в течение 2 ч при 4 С до образования геля. Затем гель замораживают при - 20 С, оттаивают до комнатной температуры и гомогенизируют до образования частиц размером 0,05-2,0 мм. Полученные частицы отмывают также в избытке физиологического раствора и автоклавируют в этом же растворе при 121 С в течение 20 мин, Выход целевого продукта составляет.45 г (масса влажных частиц МН). После автоклавирования МН отмывают раствором Хенкса до рН 7,2-7,4 с последующим ресуспендированием его в питательной среде,П р и м е р 2, Процесс получения частиц МН осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что конечную концентрацию ДЕАЕ-декстрана доводят в смеси до 0,20-",ь, содержание десятикратного раствора ЭРЛА - до 100:3,0, глютарового альдегида - до конечной концентрации, равной 0,10%, При этом смесь выдерживают при 22 С до образования геля, который в последующем замораживают при -25 С. Выход целевого продукта в этом случае составляет 47 г (влажная масса частиц).Адгезивную способность МН для клеток животных, в частности для клеток 4647 (перевиваемая линия клеток почек зеленой мартышки) и клеток РАР(перевиваемая линия клеток китайского хомячка ВбН 1 ГАЕ(клон 2373), исследует при культивировании упомянутых клеток в присутствии МН во взвеси. Через 5 ч после начала культивирования клеток с носителем из культиватора берут пробу, центрифугированием удаляют культуральную среду, а осадок, содержащий МН с прикрепленными к его по1724687 Прирост клеточной биоКонцентрация клеток в 1 мл через 6 сут культивирования, х 10 Концентрация клеток в 1 млчерез 5 чкультивирования,х 10 з КоличестИсходнаяконцентрацияяклеток,х 10 З Условия культиви" рования Микроноснтель во прикрепившихся масси через 6 суткультивиро- вания клеток,Постоянное перемешивание после внесения клеточной взвеси 7,340,4 1,2 0,6:0,02 1 О 6 о нцитоларн(известньй) Постоянное перемешивание через 5 ч поссле начала культивирования 40 вг+ОфЗ 6,7 4,0 04 6 о 72 Постоянное перемешивание сразу после внесения клеточной взвеси Микроноси"тель,лрипотовленньй 52,210,25 8,6 60 51,0.0,5 86 по предлагаемомуспособу Составитель В. ЛитовченкоРедактор И, Дербак Техред М.Моргентал Корректор А, Осауленко Заказ 1150 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул,Гагарина, 101 рования для клеток 4647 является 8,6 - 8,7- кратным, а для клеток ГАГ- 8,9-9.1-кратным.По сравнению с известным способом, где процент прикрепившихся клеток к поверхности желатиновых МН ("Цитолар") составляет через 5 ч инкубирования (в оптимальном для этого типа МН режиме, при периодическом кратковременном перемешивании МН с клетками в течение первых 5 ч инкубирования) 72 оо, а количество прикрепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, увеличивается на 14 о. В одинаковых условиях культивирования, а именно в условиях постоянного перемешивания МН с клетками в течение всего срока культивирования, включая и период адгеэии, количество при. крепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, на 76 выше, чем при использовании "Цитолара". Прирост клеточной массы при использовании предлагаемого МН в 7,1 и 1.3 раза по сравнению с "Цитоларом" выше соответственно при различных режимах культивирования.Результаты исследований сведены втаблицу,5 Формула изобретенияСпособ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток животных, включающий полимеризациюраствора желатины с образование геля,10 формирование частиц микроносителя с последующей их отмывкой, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения адгезивныхсвойств частиц микроносителя, увеличениявыхода клеток и упрощения процесса их15 культивирования, перед полимеризацией в3,5 - 4,0 о-ный раствор желатины дополнительно вносят ДЕАЕ-декстран до конечнойконцентрации 0,14 - 0,20, десятикратныйраствор Эрла до объемных соотношений20 100:(2,6 - 3,0), полимеризацию геля осуществляют добавлением глютарового альдегидадо конечной концентрации 0,08 - 0,106, гельэамораживают при ( - 20).+25) С и после замораживания иэ него формируют частицы25 микроносителя дроблением,