Способ определения изоэлектрической точки белка

А "Н-И ЕНИ ИДЕТЕЛЬСТ оюз Советских оциалистических РеспубликИЗО ВТОР СКОМУ стваМПК б 01 п 27/2 12161/31-16) ла Комитет по де м изобретений и открытий при Совете Министров СССРУДК 612.398.12(088,8 13 Х.1971 Опубликова юллетень Ъ я 8.И.19 а опублик апия опи второбретения фм,Я аявите ПОСОБ ОПРЕ КА ТРИЧЕСКОЙ ТОЧК НИЯ ИЗ 2 ависимое от авт, свидет аявлено 06.11.1970 ( присоединением заявки Приоритет Изобретение относится к биохимии и относится к способам определения изоэлектри 1 еской точки белка.В известном способе определения изоэлектрической точки белка по его электрофоретической подвижности последнюю измеряют при различных значениях рН методом подвижной границы. Однако этот способ связан с необходимостью предварительного выделения белка в гомогенном состоянии и требует его сравнительно большого расхода. При этом исследование занимает много времени, весьма сложно и предусматривает использование дорогостоящей аппаратуры.По предлагаемому способу для определения изоэлектриечских точек смеси белков используют электрофорез в электрически нейтральном акр ил амидном геле,Для получения геля необходимое количество мономеров, например акриламида и Х,Х- метиленбисакриламида, растворяют в электрофоретическом буферном растворе или в воде, добавляют 0,05 об. ч, 0,01 %-ного водного раствора рибофлавина и столько же 0,4%- ного водного раствора сульфита натрия. Смесь заливают в форму для полимеризации и освещают люминесцентными лампами в течение 10 мин. После выдерживания в электрофоретическом буфере подготовленный гель (в том случае, когда гель готовили из водного раствора мономеров) покрывают полиэтиленовой пленкой и накладывают на его концы мостики из тонкой хроматографической бумаги, увлажненные электрофоретическим буферным раствором. На мостики предварительно надевают полиэтиленовые чехлы таким образом, чтобы на геле находился участок мостика длиной 1 - 2 11 л. В имеющийся в геле канал, получение которого обеспечивается выполнением формы для полимеризации, вносят раствор исследуемого белка в электрофоретическом буферном растворе, помещают гель встройство для электрофореза и включают ток. Условия электрофореза определяются свойствами исследуемого белка. По окончании электрофореза гель помещают на 15 мин в смесь метанола, воды и уксусной кислоты (5:5:1), затем окрашивают в течение 15 - 30 лин 0,25% раствором кумасси бриллиантового синего Я в смеси метанола, воды и уксусной 1.Ислоты. Окрашенныи гель Ополаскивают 4%-ной уксусной кислотой, переносят на полоску хроматографической бумаги и помещают в ячейку для электрофоретического отмывания в 4%-ной уксусной кислоте. Отмывание проводят 5 - 6 лин при 28 - 30 в так, чтобы гель находился на стороне, обращеннойк анод.Если анализируемый белок достаточно растворим в своеи изоэлектрической точке и:аказ 1750/4 Изд. М 723 Тираж 473 Подписное ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытии при Совете Министров СССР Москва, Ж-ЗЗ, Раушская наб., д, 475 Типография, пр. Сапунова, 2 дает при электрофорезе четкую зону, то изоэлектрическая точка такого белка равна рН, при котором зона белка располагается симметрично по отно 1 цению к каналу, в который сн был помещен (по обе стороны от этого ка нала). Если растворимость анализируемого белка в изоэлектрической точке недостаточна, то измеряют миграцию и выбирают гели, в которых миграция белка минимальна, равна по величине и противоположна по направ лению. Значения рН, при которых наблюдалась такая миграция, представляют собой крайние точки интервала рН, середина которого соответствует искомой изоэлектрической точке. 15П р и м е р. Берут электрически нейтральный гель, представляющий собой сополимер акриламида и М,К-метиленбисакриламида (19: 1) при общей концентрации мономеров 4,8%. Для анализа берут несколько пласти нок геля толщиной 1,5 мм с внутренним сквозным каналом сечением 0,5 х 1 мл. Пластинки пропитывают натрий-ацетатным буферным раствором с ионной силой 0,01, но с различными значениями рН (от 4,80 до 25 4,86), Каждую пластинку помещают в форму для электрофореза, покрывают полиэтиленовой пленкой, накладывают на концы бумажные мостики и вносят по 4 - 5 лкл 0,05 - 0,1/о раствора сывороточного альбумина быка. Форму устанавливают на края электродных сосудов так, чтобы мостики погрузились в буферный раствор, и проводят электрофорез при каждом значении рН в течение 20 мин при силе тока 3 ма на пластинку и температуре 20 С. После электрофореза гель помещают на 15 мин в смесь метанола, воды и уксусной кислоты и затем окрашивают 0,25% раствором кумассии бриллиантового синего Я в смеси метанола, воды и уксусной кислоты. После ополаскивания 4%-ной уксусной кислотой пластинки переносят на полоски хроматографической бумаги и помещают их в ячейку для электрофоретического отмывания на 5 - 6 мин При электрофорезе в геле с рН 4,83 альбумин дает зону, располагающуюся симметрично по отношению к стартовому каналу. Это значение рН и соответствует изоэлектрической точке. Предмет изобретенияСпособ определения изоэлектрической точки белка, отличающийся тем, что, с целью определения изоэлектрических точек смеси белков, используют электрофорез в электрически нейтральном акриламидном геле.