Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека в крови

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН 7 2(51 5 С 01 М 33/53 ным ного (Вестерн) б МФ СССР, 1986, (54) СПОСОБ ОПР ВИРУСУ ИММУНОДЕ (57)Изобретение медицины, конкр т синдрома п дефицита, и може для определения белкам вируса ВИ повьппение чувст ние способа. В определения ант меняют БОБ-элек 4-20%-ном акрил мидном геле, виру ИзобретеЖ а именно к и ма приобрете и может быть ления нани:и. русу иммунодефицит нтител к ка (ВИЧ) ью изобр чувствит а опреде ка елов Це ениее ляется ьно и и упрощениеантител к ВИЧ,ния о ОСУДАРСТВЕКНЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЦТИРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗОБРЕ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт прикладной молекулярной биологии и Московский научно-исследовательский, институт вирусных препаратов(56) Березин В.Э. и др. Иммунодиагностика вирусных антигенов и антител к вирус антигенам методом иммунлотинга. - 1.; АМН СССР ДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ИЦИТА ЧЕЛОВЕКА В КРОВ 1 относится к области тно к иммунодиагносиобретенного иммунот быть использовано наличия антител к Ч в крови. Цель вительности и упрощепредлагаемом способе ител к белкам ВИЧ притрофорез в градиентноь е относится к медицине, ммунодиагностике синдроного иммунодефицита, использовано для опредев сыворотке крови чело 2содержащий материал - экстракты вируспродуцирующцх клеток лимфобрастоидной линии НТА. Разделенные в акриламидном геле до индивидуальных белковых полос антигены ВИЧ переносят методом электропереноса на нитроцеллюлозный Фильтр, вирусные антигены Идентифицируют и полосы нитроцеллк 1 лозных фильтров, соответствующие белкам р 24, р 55, др 4 1. др 120, вырезают н Фрагменты этих полос монтируют ннтроцеллюлозным клеем на специальную бумажную лл,.стннку, формируя диагностическую н;иску. Активную часть диагностической йолоски, представляющую собойфрагмента нитроцеллюлозных Фильтров каждый нз которых часе" на своей поверхности один белок ВИЧ; р 24, р 55, др 41, др 120, погружают в анализируемую сыворотку, разведенную 1:50 Физиологическим раствором. После инкубации диагностическую полоску проявляют с использовапием антнвидовогоГконьюгата, аналогично иммунологическому проявлению способа-прототипа Вестернблот. Для повышения достоверности результатов анализа при иммуноферментном определении используют два маркерных фермента - р -лактамазу из Васд 11 цз 1 сЬеп 1 йогпп.э и перокспдаэ у хрена.Способ осуществляют следующим образом.Проводят эМектрофорез вируссодержащего материала (экстрактов вируспродуцирующих клеток лимфоблостоидной5линии НТА) в акриламидном градиентном 4-207-ном геле с детергентом,Осуществляют электроперенос белковна нитроцеллюлозную мембрану, идентифицируют их, монтируют диагностическую полоску, проводят взаимодействие с исследуемой пробой, а связавшиеся специфические антитела выявляют, используя параллельно двамаркерных фермента: р-лактамазу из Вас 11 из 1 сЬепГоппдз 749/С и перексидазу хрена.П р и м е р 1. 1.1. Получениеэкстракта белков ВИЧ из вирус-продуцирующих клеток,1 л культуры вирус-продуцирующихклеток (лимфоблостоидная линияНТА) центрифугируют при 2000 д,.30 мин при охлаждении, Осадок, содержащий вирус-продуцирующие .клетки,используют для получения экстракта.При использовании только очищенноговирусного препарата из 1 л вируспродуцирующей культуры можно получитьдо 3500 диагностических доз (при проведении определения методом твердофазного иммуноферментного анализа). Возможность использования осадка дляполучения антигенов ИВИЧ позволяет получить дополнительно еще до 1500 доэпри проведении определения предлагаемым способом), т.е. выход увеличивается на 307Таким образом, возможность использования осадка повышает экономичностьметода.Осадок суспендируют в 0,97-ном .растворе НаС 1 в 0,1 М На-фосфатном,буфере (ЗФР) рН 7,0. Медленно, приперемешивании, добавляют равныйобъем 9 б -ного этилового спирта ксуспензии вирус-продуцирующих клетокв ЗФР, Операцию проводят при охлаждении, температура суспензии недолжна быть выше 10 С. Смесь отстаива 50ют .30 мин при комнатной температуре,а затем центрифугируют при 2000 д30 мин, Осадок собирают, гомогенизируют 15 мин в стеклянном гомогенизаторе в 0,2%.ном растворе дезоксихолата, а затем добавляют н-октилглюкозида до концентрапии 0,47 и снова гомогенизируют 15 мин, посйе чего оств-,ляют смесь на 1 ч при постоянном перемешивании, Смесь центрифугируют при20000 е 1 ч. Осадок отбрасывают, супернатант диализуют против ЗФР 18 ч. После диализа полученный экстракт вируспродуцирующих клеток замораживают ихранят при -20 С или лиофилизируют иоохранят нри 4 С.1,2. Проведение электрофореза белков ВИЧ полученных из экстракта вирус-продуцирующих клеток в акриламидном геле. Электрофорез проводят в геле толщиной 1,5 мм, размером 160 хх 160 мм с использованием 4 Х-ногоконцентрирующего акриламидного геля,рН 6,8 и градиентного 4-20 Х-ного разделяющего геля, рН 8,8. Оба геля содержат додецилсульфат На(БОБ) 0,17;Приготовление растворов для проведения электрофореза,Электродный буфер: 45 г триса,216 г глицина, 15 г БПБ, 3 л воды,рН 8,3. Перед проведением электрофореза электродный буфер разводят водой 1:5.Концентрирующий гель: 6, 1 мл воды,2,5 мп 0,5 М трис-НС 1 буфера рН 6,8,100 мкл 107-ного БПБ, 1,3 мл акриламида из ЗОХ-ного раствора акриламида, содержащего 0,87 бисакриламида.50 мкл 10 .-ного свежеприготовленногоперсульфата аммония, 10 мкл ТЕМЕД;8,8 0,17 мл 10 Х-ного БОБ, 2,3 мл307-ного акрипамида, содержащего0,8 Х бисакриламида, 0,085 мл 10 Х-ногоперсульфата аммония, 8,5 мкл ТЕМЕД.2 ОХ-ный радзделяющий гель: 1 млводы, 3,75 мл 1,5 М трис-НС 1 буфера,рН 8,8, 0,15 мл 107-ного БПБ, 10 мл307-ного акриламида, содержащего0,8 Х бисакриламида, 75 мкл 10 Х-ногоперсульфата аммония, 7,5 мкл ТЕМЕД.Раствор для образцов, 4 мл воды,1 мл 0,5 М трис-НС 1 буфера рН 6,8,0,8 мл глицерина, 1,6 мл 107-ногоИБ, 0,4 мл 2- р меркаптоэтанола,0,2 мл 0,05 -ного бромфеноловогосинего. Исследуемое вещество растворяют в растворе для образцов и прогревают 5 мин на кипящей водянойбане.Заливка градиентного геляВ первый сосуд прибора для градиентной заливки геля помещают приготовленный раствор 20 .-ного акрилами -5 . 15 ного геля, во второй сосуд помещают раствор 4/-ного акриламидного геля. Заливку осуществляют так, чтобы высота градиентного геля составила не менее 120 мм.Заливка концентрирующего геля.После заливки концентрирующего геля до полимеризации геля в раствор помещаютгре 1 евку" для электрофореза. После полимеризации геля "гре.бенку" удаляют.Планшет с заполимеризованным акриламидным гепем помещают в прибор для электрофореза фирмы "В 1 о-Вас 1" "Ргоеап//"81 аЬ Се 11 или в любой аналогичный прибор для проведения вертикального электрофореза в пластинах. Образец экстракта вирус-продуци - рующих клеток помещают в раствор для образцов и проводят операции согласно и, 1,2. На 160 мм ширины геля необходимо нанести не более 1,6 мг белка экстракта вирус-продуцирующих клеток, Кроме экстракта вируспродуцируюших клеток на одну из дорожек наносят смесь маркерных белков различной молекулярной массы.Режим проведения электрофореза.25 мА на гель для прохождения концентрирующего геля. 7-8 мА на гель для прохождения разделяющего геля. Общее время проведения элект-, рофореза 20 ч.1.3. Проведение электропереноса белков ВИЧ, полученных из экстракта вирус-продуцирующих клеток на нитроцеллюлозный фильтр.Буфер для проведения электропереноса;7,57 г триса, 36 г глицирина, 0,5 л 963-ного этилового спирта, воды до суммарного объема 2,5 л, рН 8,3.Нитроцеллюлозный фильтр, вымоченный в буфере для электропереноса, накладывают на акриламидный гель, в котором проведен электрофорез бел-ков экстракта вирус-продуцирующих клеток, На нитроцеллюлозный фильтр и на обратную сторону акриламидного геля накладывают прокладки из фильтровальной бумаги, смоченные буфером для электропереноса. Полученный блок акриламидный. гель - нитроцеллюлозный фильтр - прокладки помещают в прибор для электропереноса, заполненный буфером для электропереноса. 97728 6Электроперенос осуществляетсяпри напряжении 100 В 2 ч при охлаждении прибора.1.4. Идентификация белков ВИЧ нанитроцеллюлозном фильтре.Для определения места расположения маркерных белков различных молекулярных масс после электропереносабелков нитроцеллюлозный фильтр окрашивают 30 мин 17-ным растворомамидочерного, а затем отмывают избыток красителя ЗФР с 0,05 Е Твин(ЗФР-Т).С целью точного определения местрасположения белков ВИЧ различноймолекулярной массы, строят калибровочный график зависимости 18 молекулярной массы от длины пробега белков на 20 электрофорезе. Перед иммуноферментной индентификацией нитроцеллюлозныйфильтр инкубируют в 17-ном растворебычьего сывороточного альбумина 1 чдля инактивации оставшихся свободны ми центров связывания белков на нитрацеллюлозе. С двух противоположныхсторон нитроцеллюлозного фильтравдоль направления электрофореза отрезают две полоски шириной 2-3 мм 30 и помещают их на 1 ч в разведенную1:100 ЗФР-Т с 1 Ж-ным бычьим сывороточным альбумином пуллированную человеческую сыворотку, содержащую антитела ко всем белкам ВИЧ.Полоски от-.мывают ЗФР-Т 3 раза по 2-3 мин, затем отмывают 5 раз водой. Полоскипомещают в раствор конъюгата кроли-.чьих антител к иммуноглобулинам человека (ВАН) с пероксидазой хрена 40.на 1 ч. Проводят отмывку в ЗФР-Т3 раза и затем водой.Полоски помещают в раствор субстрата для пероксидазы: 0,057-ный раствор диаминобензидина, который содер жит .10 мкл Н О на 100 мл раствора.Через .2-5 мин инкубации, в тех местах, где локализованы белки ВИЧ,появляются полосы кирпично-красногоцвета.50 1.5. Монтаж диагностической полоски.После определения локализации белков ВИЧ иммуноферментным методом и по молекулярным массам из пластин нитроцеллюлозного фильтра вырезают полоски, соответствующие белкам яр 120, яр 4 1, р 55, р 24, так, чтобы место расположения белка на нитроцеллюлозеДиагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгате, меченном лактамазой, помещают в 2 мл иодного реагента - раствор иодинола, разведенный ЗФР в соотношении 1:3, содержащий 0,1 мг/мл бензилпенициллина. Если в испытуемой сыворотке присутствуют антитела к белкам ВИЧ, то синий иодный реагент обесцвечивается, если 50 находилось посредине вырезанной полоски,На специальную бумажную ручку снанесением на нее цифрами 1,2,3,4 нитроцеллюлозным клеем монтируются фрагменты нитроцеллюлозных фильтров, содержащие белки ВИЧ, так, что напротивцифры 1 находится белок ер 120, 2-яр 4 1.З-р 55, 4-р 24. Размеры фрагментов845 мм.Для придания ручке механическойжесткости она заклеивается прозрачной липкой лентой, при этом фрагменты нитроцеллюлозных фильтров остают ,5ся свободными (их размеры 5 Х 5 мм)и образуют активную часть диагностической полоски.1.6. Использование диагностической полоски.20Активную часть диагностическойполоски погружают в раствор исследуемой сыворотки, разведенной в соотношении 1:100 ЗФР-Т на 40 мин. В каждую из испытуемых сывороток погружают две диагностические полоски.Диагностическую полоску отмывают3 раза ЗФР-Т и водой 5. раз. По однойдиагностической полоске, проинкубированной в каждой из испытуемых сыво- З 0роток, помещают в конъюгат ВАН, меченный пероксидазой хрена, а по од-.ной - в конъюгат ВАН, меченный р-лактамазой из Вас 111 из 11 сйеп 11 оппдз749/С. С обоими конъюгатами инкубацию проводят 40 мин.Повторяют отмывку.Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгате кроличьихантител против глобулинов человека 40(КАГ), меченном пероксидазой, помещают в раствор диаминобензидина. Если в испытуемой сыворотке присутствуют антитела к белкам ВИЧ, то на активной части диагностической полоски 45появятся кирпично-красные полосы, если антитела к белкам ВИЧ отсутству-,ют - активная часть останется неок. рашенной. антитела к белкам ВИЧ отсутствуют реагент остается синим.П р и и е р 2. Дифференцированиеположительной , т.е. содержащей антитела к белкам вируса ВИЧ, "слабо- положительной", т.е. содержащей минимальное количество антител, и псевдоположительной сывороток при помощи диагностических полосок.2,1. Проведение всех операций согласно примеру 1 до инкубации о КАГ включительно,2.2. Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгатЕ КЛГ, меченном лактамазой, помещают в пробирку, содержащую 1 мл иодинола, разведенного 1:3 ЗФР и содержащего 0,1 м бензилпенициллина на 1 мл. Синяя окраска раствора исчезает, если в исследуемой сыворотке содержались антитела к белкам ВИЧ.2,3, "Положительной" можно считатьтакую сыворотку, которая при проведении операции, описанной в и. 1,6, дает окрашенные полосы на активной части диагностической полоски, при проведении операции п 1.6 раствор пенициллина в иодиноле обесцвечивается.2.4. "Слабоположительной" можносчитать сыворотку, дающую положительный ответ только с конъюгатом КАГ, меченным р-лактамазой.В случае "слабоположительной" сыворотки при использовании пероксидазного конъюгата вследствие незначительного количества присутствующих в нейантител к белкам ВИЧ может не наблюдаться видимых визуально полос нафрагментах нитроцеллюлозного фильт -ра (или эти полосы могут быть видныслабо), однако при использовании-лактамазы в качестве маркера суммируется ферментативная активность молекул иммуноферментного конъюгата,специфически сербированных на фрагментах нитроцеллюлозного фильтра,составляющих диагностическую полоску, что в совокупности с более высокой удельной активностью р-лактамазыпозволяет отличать "слабоположительные" сыворотки от "отрицательных".В этом случае можно. установить только факт наличия антител .и невозможно установить, к каким именно белкамВИЧ имеются антитела,2.5. "Псевдоположительной" можносчитать сыворотку, которая при прведении операции 1,6. дает окрашепФормула изобретения Составитель НКалининТехред М.Дидык Корректор О.Кравцова Редактор А.Шандор Заказ 3049 Тираж 518 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101,9 15ную полосу, соответствующую белкур 24, также дающую "положительный"ответ,Применение двух маркерных ферментов, различных по своей удельной активности (6-лактамаза из Вас 1 цз1 дсЬепГогЫз 749/С превосходитпероксидазу хрена по удельной активности - "числу оборотов" в 100 раз)позволяет выявить "слабоположительные" сыворотки и различать "псевдоположительные", т.еимеющие антитела только к р 24, от "положительных",т.е. имеющих антитела к несколькимбелкам ВИЧ.Таким образом, предлагаемый способ дает возможность увеличить чувствительность определения, упроститьинтерпретацию результатов и повыситьих достоверность. Кроме того, предлагаемый способ более экономичен, чемпрототип. Способ определения антителк вирусуиммунодефицита человека в крови припомощи иммуноферментного метода с ис 9772 Япользованием маркерных белков вирусаиммунодефицита человека, получаемыхиэ вируссодержащего материала методом электрофореза в акриламидном геле,электропереноса их на нитроцеллюлозную мембрану с последующей идентификацией, добавлением исследуемой пробы, выявлением специфических антителконъюгатом кроличьих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов человекас пероксидазой хрена, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повьппения чувствительности и упрощения способа, в качестве вируссодержащегоматериала используют экстракт вируспродуцирующих клеток, электрофореэпроводят в градиентном акриламидномгеле, идентификацию белков вируса 20 иммунодефицита человека осуществляютпутем монтирования фрагментов 1нитроцеллюлозной мембраны с маркерными белками в диагностическую полоску, а для выявления специфических 25 антител дополнительно добавляют конъюгаты кроличьих иммуноглобулиновпротив иммуноглобулинов человека ср-лактамазой иэ Васд 11 цз 1 хсЬеп- Еопп 1 в 749/С.