Способ получения атоксигенных вариантов возбудителя сибирской язвы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1807079 А и 9 у к 1/2 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(56) Патент США М 4328209,кл. А 61 К 39/106, 1982,п 1 ест. епцпо., 1983, ч. 39, р. 3 ательцкии 1-376,няемым ретения является упрощеспособа. Эта цель достигасреду для выращивания В,в концентрации 15 - 20% ечебную антисибиреязвенсодержащую антитоксичекоторые в специальных руют рост токсигенных клеируют рост вариантов, не миды токсигенности, т.е. Этот неизвапйгас)з эффект и24 ч инкубации, ивании Тох+Дальнейшее упроба достигается замости исследоватотсутствие (налич стный ранее для В. роявляется в первые 18 - и последующем выращиклетки и рорастают. щение и ускорение спососчет отказа от необходиь выросшие колонии на ие) токсинопродукции по зволи Изобретениболее конкретнонологии.Целью изобние и ускорениеется тем, что вапйгас)з. вводякоммерческую лную сыворотку,ские антитела,условиях ингибиток, но не ингибимеющих плазатоксигенн ых. относится к медицине, а к микробиологии и имму(56) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АТОКСИГЕН. НЫХ ВАРИАНТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ(57) Использование; микробиология, сибирская язва, возбудитель, атоксигенность, отбор, селекция. Сущность изобретения: в плотную питательную среду вводят в концентрации 15-25% коммерческую лечебную антитоксическую сыворотку, засевают 10 -5 10 спор культуры, ингибируют при 37 С в7атмосфере 6 - 25% углекислого газа в течение 18-24 ч и колонии атоксигенных клонов отсевают иглой на свежую среду, Способ обеспечивает атоксигенность всех полученных вариантов В, апйгапз, 4 табл,шеперечисленным тестам в известном способе.Описанные принци ния атоксигенных вариа осуществимы на бескап апйгасз, Поэтому при учения атоксигенных ва ции капсульных шта предварительное выдел с льных клонов. и и система выявлентов в полной мере сульных штаммах В. д необходимости пол-рриантов иэ популяммов необходимо ение из них бескапИспытуемую культуру засевают на пол- К,) усинтетическукг среду известного состава гНапез ет а 19 бб 1 с добавлением агарозы, Данная среда обеспечивает получение изолированных колоний атоксигенных вариантов В. апс)гасз. Посевы инкубируют в течение 18 - 24 ч, при 37 С в атмосфере 6- 25% СО 2. Посевной материал наносят на5 6 плотную среду в дозе, не меньшей 10 -10 клеток.Сочетание указанных приемов поло достичь укаэанной цели и обеспечитьатоксигенность всех получаемых вариантовВ. апйгасз,П р и м е р 1. Получение атоксигенныхвариантов из популяции бескапсульныхвакцинных штаммов В, апйгасз СТИ иСтерне.Готовится среда следующего состава(Напез В, Ю., Кеи Р. а.псоп В. Е,Оцапбта 1 ае аззау аког сгибе ап 1 Ь ах тохпз //.1,Вас 1 его. - 1965, - ч. 89 - М 1, - Р. 74-83),мг/л:СаС 2 2 Н 20 7,36М 95047 Н 20 9,9Мп 504Н 20 0,9КН 2 Р 04 680,0К 2 Н РО 4 872.0чаН СОз 9900,0Тиамин НС 0,5Аденин-сульфат 2,0Урацил 1,4Л-триптофан 52,0Л-цистеин 1,0Л-глицин 15,0Казаминовые кислоты 3600,0Глюкоза 2000,0.АгароэаДо 2%Дистиллированная вода До 1 лрН среды 8,5Непосредственно в день работы в расплавленную и охлажденную до 45 С средувносят коммерческую лечебную антисибиреязвенную сыворотку до 20%, бикарбонати глюкозу; среду разливают в чашки Петри.Инокулум В. апйгасз для посева на средуготовят в концентрации 10 клеток на 1 мл,Засевают на пластинки среды пипеткой по0,1 мл или петлей из агаровой колонии 1 - 2сут возраста, Общее количество клеток внесенных на пластинку агара должно быть неменее 10 .Чашки инкубируют и ри 37 С в атмосфере СО 2 (от 6 до 25%) в течение 18-24 ч,Вырастающие колонии являются атоксигенными вариантами, их отсевают на свежуюсреду иглой. Колонии, вырастающие после26 ч.инкубации, являются Тох -вариантами.Атоксигенность полученных клонов попредлагаемому способу удостоверяется методами ин виво (заражение крыс линии фишер или внутрикожной пробой на морскихсвинках с культуральной жидкостью исследуемых клонов) и ин витро (иммунодиффузия с антитоксической сывороткой иплаэмидный анализ),П р и м е р 2. Получение атоксигенныхвариантов из популяции капсульных вирулентных штаммов В, аптЬгас 1 з 88/1 и 44/1,Взвесь спор (не менее 10 /мл) по 0,1 млвысевают на пластинки упомянутой среды,содержащей 20/, нормальной лошадиной сыворотки. Посев инкубируют 1-2 сут в атмосфере 6-25% СО 2 при 37 С, Среди выросших слизистых колоний (капсульные клоны) отбирают шероховатые колонии или секторы колоний (бескапсульные клоны). Последние высевают на данную среду сантисибиреяэвенной сывороткой (см. при-мер 1) и через 1 сут снимают атоксигенныеклоы.П р и м е р 3. Получение атоксигенныхвариантов В. апйгасз СТИ и Стерне в присутствии разных концентраций иммуннойсыворотки. Все этапы работы те же, что и в15 примере 1, за исключением того, что сыворотку вводят в концентрации 10, 15, 25,30%,Результаты отражены в табл. 1.Таким образом, оптимальной концентрацией антисибиреязвенной сыворотки для20 получения Тох вариантов является 15 - 25%,П р и м е р 4. Голучение атоксигенныхвариантов В. апйгасз Сти и Стерне в зависимости от концентрации посевного материала, Все этапы опыта те же, что и в25 примере 1, за исключением того, что дозыпосевного материала варьировали; 10, 10,Г 710 и 10 спор. Результаты отражены втабл, 2.Таким образом, оптимальной для пол 30 учения Тох вариантов является посевнаядоза 10 -10 спор,П р и м е р 5, Получение атоксигенныхвариантов В. апсЬгас 1 з Сти и Стерне в зависимости от концентрации СО 2, Все этапы35 опыта те же, что и в примере 1, за исключением того, что посевы выращивали при разных концентрациях СО 2, Результатыотражены в фабл, 3,Из табл, 3 видно, что существенным40 фактором является наличие СО 2 в инкубаторе (при концентрации газа меньше чем 6%наблюдается недифференцированный ростобоих типов колоний). Повышение концентрации газа более 6% не влияет на результат.45 П р и м е р 6. Получение атоксигенныхвариантов при различных сроках инкубации.Все этапы опыта те же, что и в примере1, за исключением того, что посевы выращи 50 вали 10, 18, 24 и 36 ч. Реэультать, отраженыв табл,4,Таким образом. оптимальный срок инкубации культур по предлагаемому способу18-24 ч,55 Суммируя вышеизложенное можно заключить, что предлагаемый способ позволяет получать атоксигенные варианты В,апйгасз, Последние могут найти применение при генетических исследованиях (дляизучения признака токсинообразования у1807079 Таблица 1 Зависимость выхода Тох - вариантов от различных концентраций антисибиреязвенной сывороткиОбозначения: + - наличие колоний Тох - ва-- отсутствие ростах - совместный рост Тох и Т ианто вариантов. абли Тох - колоний пр разной посевной доз чет бозначения те же, что и в табл, 1+ - редко встречающи ох -колонии Табл нтраций СО- вариантов от различных исимость выхо Обозначения те же, что и в табл. 1 микроба, для внедрения в бесплазмидные штаммы любых других плазмид с полезными свойствами), а сам способ может быть применен при исследовании соотношения числа Тох (иммуногенных) и Тох (неимуногенных) клеток в популяциях культур В, ап 1 пгасз, предназначенных для использования в качестве вакцин,Формула изобретения Способ получения атоксигенных вариантов возбудителя сибирской язвы путем посева спор в питательную среду, инкубирования в условиях, обеспечивающих элиминацию плазмиды токсигенности, с последующим пересевом и скринингом колоний на плотной питательной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения иускорения способа, для посева используют плотную питательную среду, включающую 15-25 ф, лечебной антисибиреязвенной сыворотки, засевают спорами в концентрации 10 10 - 10 кл/см, а инкубируют при 37 С ватмосфере 6 - 25 углекислого газа в течение 18-24 ч.1807079 Таблица 4 Учет роста колоний Тох -вариантов при различных сроках инкубации В емя инк ба ии, ч Штамм 18 10 24 36 Редактор Л.Волкова Заказ 1360 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР . 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 Стк Сте не