Способ определения активности холестеролэстеразы

(51)4 С 1 СССР КРЫТ ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМ ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ юл. Р 18охимии АН Лологии и виого логи И.В.Бахм В-.С.А.Лаур Е,А.Киприа тов нав ова чу(54) СПОСОБ ХОЛЕСТЕРОЛЭС (57) Изобрет химическим .м зованием Фер ПРЕДЕЛЕНИЯ АК ОСТИ.ТЕРАЗЫ ние относится к электр тодам анализа с исполь ентов и может быть исАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ) Патент СЧА Р 40522кл. С 12 1) 13/00, опублик пользовано в промьппленности при обнаружении холестеролэстеразы в средахее выращивания, а также в диагностических целях в медицине. Цель изобретения - упрощение способа определения активности холестеролэстеразы.Способ заключается в том, что привзаимодействии холестеролэстеразы ссубстратом осуществляется электролизреакционной смеси в присутствии холестеролоксидазы, платинового электрода, покрытого трехслойной мембрлой,при 0,6 В отп, Ад/А 8 С 1, электродасравнения, а определение активностипроводится по скорости увеличенияанодного тока в ячейке. Способ является пригодным для анализа окрашен-;ных, непрозрачных сред микробиологи-ческой промьппленности. 3 табл.-. Холестерин + Олеиновая кислота холестеролоксидаза Холестерин + О Холестенон + Н ОИзобретение относится к электрохимическим методам анализа материаловпутем измерения тока при электролизес использованием ферментов, конкретно . к способу определения активности холестеролэстеразы, и может быть использовано в.промьппленности для определения холестеролэстеразы, а также в диагностических целях в медицине.Цель изобретения. - упрощение способа.Способ предусматривает взаимодействие холестеролэстеразы с субстратом - холестернловым эфиром непредельной высшей кислоты в фосфатномбуферном растворе в присутствии холестеролоксидазы и определение активности по величине скорости изменения измеряемого параметра, при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом проводят электролиз реакционной смеси в присутствии рабочегоэлектрода, покрытого трехслойной защитной мембраной, при +0,6 В отн. : Ад/АдС 1 электрода сравнения, а активность холестеролэстеразы определяЗлектрохимическое окисление Н О на Р электроде при 0,6 В отн. Ар/АрС 1,электрода сравнения генерирует анодный ток. Скорость увеличения анодного тока пропорциональна скорости образования перекиси водорода, ко торая пропорциональна скорости гидро- лиза холестерололеата, т,е. пропорциональна активности холестеролэстеразы. Угол кинетической кривой отражает скорость гидролиза холестерололеата- Способ осуществляют следующим образом,В измерительную ячейку, содержащую 1 мл буферного раствора, погружают электрод, вводят 0,02 мл холестерололеата, 0,02 мл холестеролоксидазы. Регистрируют стационарный ток в течение 0,5-1 мин, затем вводят 002 мл исследуемого раствора, содер 55 жащего холестеролэстеразу и регйстрируют увеличение анодного тока в течение 3-4 мин, рассчитывают ферментативную активность; исходя из танют по скорости увеличения анодного тока.В качестве рабочего электрода используют платиновый электрод, в качестве буферного раствора - 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0-9,0, в качестве субстрата - холестерололеат.В интервале рН 7,0-9,0 раствора обеспечивается чувствительность измерений, а в более кислых средах уменьшается каталитическая активность холестеролоксидазы и уменьшается чувствительность способа.,Концентрация холестеролоксидазы составляет 0,33-0,5 ед/мл концентрация холестерололеата 5-10 мМ. Ниже указанных пределов концентраций наблюдается зависимость тока от концентраций холестеролоксидазы и холестерололеата, в то время как при определении ток ячейки должен полностью отражать только активность холестеролэстеразы. Использовать более высокие концентрации экономически невыгодно и нецелесообразно.Протекают следующие превращения:генса угла наклона кинетической кри-вой увеличения тока в течение первых3-4 мин. Из экспериментально полученной величины Ь 1 , нА/мин и ответа электрода на стандартную концентрацию холестерина (40 мкМ) в отсутствии холестерололеата и холестеролэстеразы вычисляют скорость ферментативной реакции (скорость образова-.ния холестерина в ячейке в мкмоль/мин)и удельную активность холестеролэстеразы из трех параллельных измерений. Удельную активность препарата(Е/мг) можно вычислить также из построенного калибровочного графика(концентрация фермента - скоростьферментативной реакции). После измерения тока ячейка в течение 1,5 минпромывается буферным раствором, после чего можно проводить следующее измерение.П р и м е р 1. Определение зависимости величины тока от концентрации холестеролоксидазы.Электролиз проводят в присутствии0,2 мМ холестерина в ячейке в 0,05 Мфосфатном буфере, рН 7,2 и разных количеств холестеролоксидазы,Полученные данные приведены втабл. 1.Данные показывают, что зависимостьтока от концентрации холестеролоксидазы наблюдается до 0,33 ед/мп.,П р и м е р 2, Определение зависимости величины изменения тока отконцентрации холестерололеата.Электролиз проводят в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5, в присутствии0,5 ед/мл холестеролоксидазы,0,14 ед/мл холестеролэстеразы и разных количеств холестерололеата.Данные приведены в табл. 2.Из табл . 2 видно, что минимальнаяконцентрация холестерололеата вячейке должна быть 5 мМ,П р и м е р 3. Определение активности холестеролэстеразы.Электролиз проводят, как в примере 2, в присутствии 7 мМ холестерололеата, 0,45 ед/мл холестеролоксидазь.Вводятся разные объемы раствора холестеролэстеразы и записываются кинетические кривые изменения тока. 30Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают величину тока при использовании стандартного раствора холестерина (40 мкМ),которая была равна 33,3 нА, При введении в ячейку 10 мкл (20 мкг) исследуемого раствора холестеролзстеразыизменение тока составляет 5,2 нА/мин.Из этих данных вычисляют скоростьферментативной реакции: 40 мкМ - 4033,3 нА, х - 5,2 нА/мин, х =- 6,24 мкМ/мин (в 1 л). или. 6,24"х 10мкмоль/мин в 1,0 мп (в ячейке).Следовательно, 6,2410ед холестеролэстеразы было в 10 мкл образца, а в 1 мп препарата было 0,624 ед.фермента. Поскольку исследуемый образец содержал 2 мг/мл белка, то удельная активность фермента, вычисленнаяиз одного измерения, составляла 500,312 Е/мг. Аналогично вычислены идругие активности.Для удобства проведения расчетовпри непрерывном анализе большого количества проб используют формулуа Ъ,А ед/мл = 1 -- - 11000где 1 с - коэффициент,.равный концентрации холестерина, мкМ, которая способствует изменениютока в ячейке 1 нА;а - измеренное изменение тока,нА/мин;Ъ - степень разбавления исследуемого образна, раз.гНапример, при введении в ячейку 1 О мкл исследуемой холестеролэстеразы получают40 мкМ- 1 2 а = 5,2.нА/мин33,3 нА1 Ь = 100 раз;1 25 2 ф 100А, ед/мл = - - - --- = 0,624,1000При введении в ячейку 20 мкл получают: 1 с = 1,2; а = 10,5 нА/мин; Ь = = 50 раз1 2 а 10 5 50А ед/мл = -д -- = 0 63.У 1000Аналогично рассчитаны и другие активности. Данные приведены в табл. 3.1Из табл. 3 видно, что наблюдаетсястрогая прямолинейность увеличениятока (Ь 1) от активности холестеролэстеразы в ячейке. Вычисленные удельные активности препарата из любойточки близки (среднее 0,308 Е/мг белка). Вычисленная удельная активностьиз построенного калибровочного графика (скорость реакции - количествохолестеролэстеразы) составляет0,305 Е/мг, т,е. практически совпадает.,Предлагаемый способ является простым и экспрессным, так как отпадаетнеобходимость приготовления радиоактивного субстрата или прозрачных образцов, применения пероксидазы и одианизидина. Метод основан на исполь"зовании простого оборудования и обеспечивает воэможность автоматизациипроцесса. По сравнению с электрофотометрическим методом используется в10 раз меньше исследуемого образца,а время одного анализа в 6 раз короче: Процесс определения можно проводить непрерывно, например при ходевыделения или очистки ферментаТаким образом, упрощение способазаключается в сокращении времени определения до 4 мин, в возможности автоматизации процесса, в использова"нии более простого оборудования, висключении дополнительного примененияпероксидазы и о-дианизидина.1395677 лью упрощения способа, реакционнуюсмесь помещают в электрохимическуюячейку и подвергают ее электролизу вприсутствии платинового электрода,покрытого трехслойной защитной мембраной, а холестеролэстеразную активность оценивают по увеличению анодного тока Таблица 1. Холестеролоксидаза,ед/мл 0,033 0,066 0,130 0,200 0,260 0,330 0,500 120 230 275 290 300 301 Ток электрода, нА 60 Таблица 2,Увеличение тока электрода, нА/мин 0,96 1,41 2,0 Таблица 3 ЬТ,нА/мин Количество хо- лестеролэстера Рагсчитанная ско- Рассчитанная рость ферментативной реакции ая активность пре еике мкл кмоль/мин мл ед/м Е 4 10.ек тор каз 2468/ 520 Лодпи венного комитета СССР27 ТиражВНИИЕИ Государпо делам изо13035, Москва, Ж е нии и открытииРаушская наб д, 4/5 е 5 ческое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 зводственно-поли Формула изобретенияСпособ определения активности хопестеролэстеразы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, раствор фермента и субстрат, инкубацию ее и последующую оценку результатов, о тл и ч а ю щ и й с.я тем, что, с це 2,41 2,80 2,81 2,80