Способ выявления мутаций 8-го кодона (-аа) бета-глобинового гена

/48 5 6 0 ПИСА ИЗО АТЕН ательскии институт логии Министерства ербайджанской РеЮ.Мамедов.Мамедов43 в 2,О Интерпр следующим наблюдаетс ной 236 кб мальном сос одной фрактельствует о гомозиготно розигот отм ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(56) В 3 ооб 1988 ., Ме 1,Изобретение относится к молекулярнои биологии, конкретно к способам выявления мутации гена бета-глобина, и может быть использовано в медицине, в частности в медико-генетическом консультировании.Целью изобретения является быстрое и упрощенное нерадиоактивное электрофоретическое определение мутации 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена,Сущность изобретения заключается в том, что из 0,5 - 1,0 мл цельной крови выделяют клеточную ДНК. Затем с помощью двух комплементарных 19-членных олигонуклеотидных праймеров (0,6 мкг/мкл), буфера, всех четырех дезоксинуклеотидов (АТФ, ТТФ, СТФ и ГТФ) и фермента термофильной ДНК-полимеразы проводят амплификацию - полимеразную цепную реакцию фрагмента бета-глобинового гена, где расположена мутация.Амплификат у гетерозигот с мутацией 8-го кодона состоит из двух комплементарных фрагментов ДНК, один из которых на два нуклеотида (-АА) короче другого; у гомозигот оба фрагмента короче на два нуклеотида по сравнению с нормой. Наличие(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ 8-ГО КОДОНА (-АА) БЕТА-ГЛОБИНОВОГО ГЕНА (57) Использование; медицинская биохимия. Сущность изобретения: выделяют клеточную ДНК, проводят ее амплификацию амплификат разделяют электрофорезом гель окрашивают водным раствором этидия бромида, а о наличии мутантного гена судят по появлению фракции длиной 200 кбаз. выпадения двух нуклеотидов (-АА) влияет на молекулярный вес, а также на заряд фрагмента гена - ДНК, что легко выявляется путем электрофореза на полиакриламидном геле, Амплификат разделяют на 80 полиакриламидном геле путем электрофореза, используя обычный режим (напряжение 150 В, сила тока 22 мА, время 1 ч). В качестве контроля используют также маркер - фаг Х 174 разрезанный рестриктазой Нае Ш, После электрофореза гель окрашивают 5 - 10 минут водным раствором этидиум бромида, Наличие дополнительной фракции в районе 200 кбаз свидетельствует о наличии мутантного гена с делецией двух нуклеотидов (-АА) в кодоне 8 бета-глобинового гена. етацию результатов проводят образом: у нормальных людей я наличие одной фракции с длиаз. свидетельствующей о нортоянии обследуемого, Наличие ции с длиной 200 кбаз свидеделеции двух нуклеотидов - о сти по данной мутации. У гетеечаются две полосы с размера1801210 Формула изобретения Способ выявления мутаций 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена, включающий выделение клеточной ДНК и ее амплификации,отл и ча ющийся тем, что,с целью ускорения способа, амплификат разделяют электрофорезом, гель окрашивают водным раствором этидий бромида и при наличии фракции с длиной пробега 200 кбаз выявляют мутацию 8-го кодона,СоставительТехред М.Моргентал Редактор Корректор Л.Пилипенко Заказ 1190 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 ми 236 кбаз (норма) и 200 кбаз (мутация 8-гокодона).Упразднение процедур в прототипе: перенос амплифицированного фрагментаДНК на нейлоновый фильтр, предгибридизация, гибридизация с радиоактивным олигонуклеотидным зондом, приготовленияэтого зонда, ауторадиография значительносокращает время определения мутации 8-гокодона (-АА) бета-глобинового гена от 5 - 6дней до 1 - 2 дней. При этом сокращаетсябольшое количество приборов и химреактивов с сохранением точности определения,Таким образом, предлагаемый способ ссохранением точности значительно ускорит 15и упростит определение мутации 8-го кодона (-АА), что даст возможность получить достоверную информацию о молекулярномнарушении бета-глобинового гена,П р и м е р 1, Обследуемый Адигезалов 20Яшар (32 года) был обследован на носительство мутации 8-го кодона бета-глобиновогогена. У обследуемого было взято 0,1 мл крови из пальца, выделена клеточная ДНК, амплифицирована, и проведен электрофорез 25на полиакриламидном геле (8%) при 150 В,22 мА, время 1 ч,Выявлена мутация 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена,П р и м е р 2. Адигезалова Парвана (30 30лет) была обследована на носительство мутации 8-го кодона бета-глобинового гена, Уобследуемой было взято 0,1 мл крови изпальца, выделена клеточная ДНК,амплифицирована и проведен электрофорез на 8% 35полиакриламидном геле, при 150 В, 22 мА,время 1 ч. Гель окрашен 5 - 10 мин воднымраствором этидиум бромида,Выявлена мутация 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена, 40П р и м е р 3, Адигезалов Малик (8 лет)был обследован на гомозиготное носительство мутации 8-го кодона бета-глобиновогогена, У обследуемого был взят 0,1 мл кровииз пальца, выделена клеточная ДНК, амплифицирована и проведен электрофорез. В отличие от родителей Адигезалов Малик имелгомозиготное носительство мутации 8-го кодона бета-глобинового гена. На электрофо-.реграмме после окрашивания этидиум 50 бромидом выявлена одна полоса ДНК с длиной 200 кбаз, соответствующая гомозигот.ности мутацииП р и м е р 4, У Адигезаловой Парваныпри сроке беременности 10 недель быливзяты ворсинки хориона (клетки плаценты)с целью пренатальной диагностики плода.Из ворсин хориона была выделена клеточная ДНК, амплифицирована и проведенэлектрофорез. После электрофореза полиакриламидный гель был окрашен воднымраствором этидиум бромида, На электрофореграмме были выявлены две полосы амплификата длиной 200 и 236 кбазсоответствующий гетерозиготному носительству мутации 8-го кодона, Данная беременность была сохранена,После рождения у новорожденного была взята пуповинная кровь в количестве 0,1мл. Выделена клеточная ДНК, амплифицирована и проведен электрофорез на 8% полиакриламидном геле, при напряжении 150В, силе тока 22 мА, времени 1 ч, Окрашиваливодным раствором этидиум бромида,На электрофореграмме выявлены двеполосы с длиной 200 и 236 кбаз, что свидетельствует о гетерозиготном носительствемутации 8-го кодона у новорожденного,Этот анализ полностью подтвердил результат, полученный при пренатальной диагностике,Таким образом, предлагаемый способ ссохранением точности значительно ускоряет и упрощает выявление мутации 8-го кодона (-АА), что дает пренатально(внутриутробно) и постнатально (после рож- .дения) возможность получить достовернуюинформацию о молекулярном нарушениибета-глобинового гена,