Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе

(51)5 6 01 Й 33/53 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ОМУ ЕТЕЛЬСТВ К А по 1. Мейобз,ГОСУДАР СТВ Е ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА ПРИ ФАГОЦИТОЗЕ(57) Изобретение относится к медицине иможет быть использовано для определениясупероксидного анион-радикала при фагоцитозе. Цель изобретения - повышение чувИзобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и касается способа оценки интенсивности свободно-радикальных процессов в крови.Цель изобретения - повышение чувствительности, точности способа и сокращение времени исследования.Способ осуществляется следующим образом.У донора берут 8 - 10 мл венозной крови (в пробирку с гепарином из расчета 10 мкл гепарина на 1 мл крови). Выделяют лейкоциты отстаиванием крдви в пробирке в течение 1,5 - 2 ч или центрифугированием ее при 500 об/мин 5-7 мин; при этом кровь расслаивается на три слоя; нижний эритроцитарный - красного цвета, средний лей коцитарный - в виде тонкой белесоватой пленки и верхний - плазменный; отсасывают средний слой (лейкоцитарный) и большую часть верхнего плазменного слоя и ствительности, точности способа и сокращение времени анализа. У обследуемого берут кровь, выделяют лейкоциты, инкубируют в присутствии нитросинего тетразолия и опсонированными. плазмой частицами зимозана при 38,5 - 39,0 С, Реакцию останавливают 5 М соляной кислотой, затем проводят центрифугирование и осадок экстрагируют смесью диметилсульфоксида и хлороформа, взятых в соотношении 2:1, при 55-59 С с последующим определением супероксидного анион-радикала спектрофотометрически, По сравнению с прототипом чувствительность способа возрастает на 55 , точность в 10 раз при сокращении времени анализа в 4 раза. переносят в центрифужную пробирку; центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин. Образовавшийся осадок - это лейкоциты. Освобождают . лейкоциты от примеси эритроцитов посредством мягкого осмолизиса - добавлением 6 мл дистиллированной воды на 10 с и остановкой его восстановлением изоосмолярности добавлением 2 мл гипертонического (3,6 О/) раствора поваренной соли, Центрифугируют при 1000 об/мин, отбрасывают супернатант; осадок, состоящий из лейкоцитов, дважды отмывают 6 - 8 мл физиологического раствора (рН - 7,35), разводят полученную лейкоцитарную взвесь физиологическим раствором (рН - 7,35) до конечной концентрации лейкоцитов Зх 10 ф в 1 мкл. Затем 0,2 мл лейкоцитарной взвеси переносят в пробирку, добавляют 0,5 мл 0,2 о-ного раствора нитросинего,тетраэония (Н СТ) и 0,2 мл раствора, содержащего опсонизированные плазмой частицы зимо 1735784раствора НСТ и 0,2 мл опсонизированного 30зимозана (из расчета 70 - 100 частиц зимозана на 1 лейкоцит), Смесь инкубируют в термостате при температуре 38,5 С в течение1,5 ч. После этого для остановки реакциидобавляют 1 мл 5 М раствора соляной кислоты. Сразу же дважды экстрагируют гранулы образовавшегося осадка формазанов -смесью ДМСО с хлороформом в соотношении 2:1 при 55 С, каждый раз по 15 мин.Затем проводили спектрофотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм. В 50 55 зана из расчета 70 - 100 частиц зимозана на 1 лейкоцит. Смесь инкубируют в термостате при температуре 38,5 - 39,0 С в течение 1 - 1,5 ч. После этого добавляют в пробирку 1 мл 5 М раствора соляной кислоты (для остановки реакции), центрифугируют смесь при 3000 об/мин в течение 10 мин, супернатант удаляют. Осадок, состоящий из продуктов реакции взаимодействия супероксидного ариона - радикала (САР) и НСТ - формазанов, экстрагируют 3 мл раствора, содержащего 2 мл диметилсульфоксида и 1 мл хлороформа в течение 15 мин при 55 - 59 С. Затем повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и вновь проводят экстракцию, После этого проводят спектрофотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм. Контролем служит смесь диметилсульфоксида (ДМСО) и хлороформа в соотношении 2:1, Результаты измерений двух экстрактов суммируются: вместе они показывают концентрацию САР по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия САР с НСТ-формазанов в единицах оптической плотности (ЕОП),П р и м е р 1. У донора берут 8 - 10 мл крови (мужчина 21 года, группа крови О/1), К 0,2 мл взвеси лейкоцитов (концентрация 3000 в 1 мкл) добавляют 0,5 мл 0,2 -ного качестве контроля использовали смесь ДМСО с хлороформом в соотношении 2:1. Данные спектрофотометрических измерений двух экстрактов суммировали. Суммарная величина показывала концентрацию САР по оптической плотности продуктов реакции САР и Н СТ-формазанов, Результат: 0,248 единиц оптической плотности; (0,193+ 0,055 ВОП), общее время проведения исследования 3 ч.П р и м е р 2. Кровь того же донора, К 0,2 мл взвеси лейкоцитов (3000 в 1 мкл) добавили 0,5 мл 0,2-ного раствора НСТ и 0,2 мл взвеси опсонированного зимозана (из расчета 70 - 100 частиц на 1 лейкоцит), Инкубировали смесь в термостате при температуре 39,0 С в течение 1,5 ч, Для остановки реакции добавили 1 мл 5 М раствора соля 5 10 15 20 25 ной кислоты. Сразу же после этого образовавшийся осадок гранул формазанов (продукты реакции САР и НСТ) дважды экстрагировали смесью ДМСО с хлороформом в соотношении 2;1 при 55 С, каждый раз по 15 мин, Затем проводили спектрофотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм, В качестве контроля использовалась смесь ДМСО с хлороформом в соотношении 2;1. Данные спектрофотометрий двух экстрактов суммировали. Суммарная величина показы вала кон цент- рацию САР по оптической плотности продуктов реакции САР и НСТ-формазанов в ЕОП, Результат 0,245 единиц оптической плотности; общее время проведения исследования 3 ч (0,205+ 0,040 ВОП).В заключении следует отметить, что предлагаемый способ выгодно отличается от известного тем, что его выполнение требует в 4 раза меньше времени (около 3 ч), чем по известному (12 - 14 ч), повышает чувствительность в среднем на 55(количество образующегося САР по концентрации конечного продукта реакции САР и НСТ- формазанов по предлагаемому способу составляет в среднем 0,245 ЕОП, а по известному 0,1575, уменьшает разброс результатов исследования (количество образующегося САР по концентрации формазанов ъ в 10 раз) по предлагаемому способу -0,243- 0,248 ЕОН, Л= 0,005; по известному 0,122 - 0,172 ЕОП, Л = 0,05, повышает точность исследования (по предлагаемому способу средняя ошибка п равна 0,00084, по известному - 0,01284).Формула изобретения Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе, включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их с опсонизированными частицами зимозана и нитросиним тетразолием, добавление соляной кислоты, экстракцию органическим растворителем и определение содержания супероксидного анион-радикала по оптической плотности экстракта с помощью спектрофотометра, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения чувств ител ьности, точности способа и сокращения времени анализа, лейкоциты инкубируют с опсонизированными частицами зимозана при 38,5 - 39,0 С, для остановки реакции используют 5 М раствор соляной кислоты, в качестве органического растворителя используют смесь диметилсул ьфоксида ихлороформа, взятых в соотношении 2;1, перед спектрофотометрией экстракцию растворителем проводят при 55 - 59 С,