Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона

(НО)с. Илона ЕЧЕСКОРОНАицинеиеческогоа. Целью едицине, а епаратов, и овеческого. нао ГОСУДАРСТВЕН ЪЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО(71) Эдьт Дьедьсерведьесети Дьяр(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОМГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФ(57) Изобретение относится к мекасается способа получения челолейкоцитарного а- и у-интерферон Изобрете именно к пр касается спо лейкоцитарн Наиболе ляется спосо коцита рного чающийся в тов, удалении ровании сусп ной среде и иние относится к моизводству биопрсоба получения челого интерферона.е близким к предлагаемому явб получения человеческого лейа- или у -интерферона, заклюотделении фракции лейкоцииз нее эритроцитов, культивиенэии лейкоцитов в питательобработке соответствующим ндуктором для индукции а или у.интерфе рона. Однако известный способ позволяет олучать на одной и той же культуре только а- или у- интерферон.елью изобретения является получениеой и той же культуре последовательно нтерферона,изобретения является получение на одной и той же культуре лейкоцитов последовательно а- и уинтерферона. Способ заключается в отделении фракции лейкоцитов крови (Ьцйу соат), удаленйи иэ нее лейкоцитов, культивировании суспензии лейкоцитов в питательной среде.в присутствии 200 МЕ/мл а-интерферона в течение 2 ч, Индукцию осуществляют вирусом Сендай в кон-, . центрации 400 ГЕ/мм, культивируют 18 ч и отделяют надосадочную жидкость, содержащую а-интерферон, Осажденные клетки лейкоцитов промывают, суспендируют в питательной среде, обрабатывают конконавалином А, культивируют 16 ч и отделяют надосадочную жидкость, содержащую уинтерферон. П р и м е р 1. Взятую кровь, помещенную в раствор АО (водный раствор, содержащий лимонную кислоту и декстрозу), в течение 3 ч хранят при 4 С. Одну обьемную часть полученного таким образом концентрата лейкоцитов смешивают с пятью обьемнь 1 ми частями 0,83;-ного водного раствора хлористого аммония при охлаждении на ледяной бане. Суспензия содержится на ледяной бане до тех пор, пока не произойдет лизирование эритроцитов (5-10 мин). После чего суспенэию лейкоцитов культивируют в питательном растворе следующего состава, мг/л:Хлористый кальций 175-350 Хлористый калий 300-500 Сульфат магния илиэквивалентное количество хлористогомагния 175-5005000-7000200-3500 Хлористый натрийБикарбонат натрияМоноэамещенныйфосфат натрия 30-150 Глюкоза 500-5500 Нитоат железа (В) 0,0-0,2 При этом можно применять питательную среду Игла, модифицированную МЕМ Дульбекко, модифицированную МЕМ Глазгова,Указанное лиэирование зритроцитов повторяют таким образом, что на 1 об. ч. суспензии лейкоцитов рассчитывают применение 10 об. ч, 0,83-ного водного раствора хлористого аммония. Образуется суспензия лейкоцитов в питательном растворе, вслед за тем число клеток устанавливают равным 10 клеток/мл. Питательный7раствор содержит 2 мг/мл свободной от глобулина сыворотки человеческой крови (около 6 ф), Клетки обрабатывают при 37 С при постоянном помешивании 200 МЕ/мл свободного от индуктора концентрированного человеческого а-интерферона. Через 2 ч клетки индуцируют 400 гемаглютинированных единиц вируса Сендая, Инкубацию заканчивают через 18 ч после индуцирования, Антивирусный титр суспернативной жидкости, т.е, сырого а- интерферона, составляет 54, 200 Е/мл, Клетки, использованные для получения а-интерферона один раз, промывают названным питательным раствором, после, чего образуется суспензия лейкоцитов в питательном растворе при концентрации 2,5 10 клеток/мл. Питательный раствор содержит 1 мг/мл свободной от глобулина сыворотки человеческой крови (около .3). Затем клетки стимулируют посредством 15 мкг/мл конканавалина А, Инкубацию проводят при постоянном помешивании при 37 С и через 16 ч после индуцирования надоСадочную жидкость отделяют от клеток. Антивирусный титр надосадочной жидкости, которая содержит уинтерферон, определяют на человеческих амниальных клетках ЧЧЗН. Кроме того, титры выражаются в сравнении со стандартом человеческого а-интерферона в виде международных единиц(млМ/Е/мл), В настоящее время нет никакого признанного международного стандарта интерферона. Титр суспернативной жидкости составляет 10,600 МЕ/мл и является потенцированной величиной, поскольку препарагы у-интерферона содержат также гг-интерферон, С помощью градуирующей кривой и на основе титра первоначального и обработанного при значении рН 2 вещества фактическое содержание у.интерферона составляет 1,840 М Е/мл.5 Для сравнения вышеописанный способ проводят с.тем изменением, что клетки перед производством у-интерферона инкубируют. ся в течение одного дня беэ обработки вирусов Сендая, Полученный под воздействием 10 конканавалина А титр у-интерферона составляет 340 МЕ/мл.Для дальнейшего сравнения исключаютпервый, т,е. производящий а-интерферон период и изолированные лейкоциты инду цируют непосредственно конконавалиномА. Титр у-интерфнерона составляет 450 МЕ/мл.П р и м е. р 2. Действуют аналогичнопримеру 1 с тем отличием, что в качестве 20 питательного раствора применяют питательную среду Игла, Полученный таким образом титр а-интерферона составляет 56,000 МЕ/мл, Во второй ступени способа в том же самом питательном растворе дости гается титр у-интерферона, равный 1,680МЕ/мл, Если при этом способе исключить производство а-интерферона, то титр уинтерферона составит 280 МЕ/мл.Предлагаемый способ позволяет на од ной и той же культуре лейкоцитов получатьа- и у-интерфероны с высоким титром,Формула изобретения Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона путем деления 35 фракции лейкоцитов крови, удаления из нееэритроцитов, культивирования суспензии лейкоцитов в питательной среде, обработки их индуктором интерферона и отделения надосадочной жидкости, содержащей ин терферон, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью получения на одной и той же культуре последовательно а- и у-ирнтерферона, культивирование суспензии лейкоцитов проводят в присутствии 200 МЕ/мл а-интерфе рона в течение двух часов, в качестве индикатора используют вирус Сендай в концентрации 400 ГЕ/мл, культивируют 18 ч., отделяют надосадочную жидкость, содержащую а-интерферон, осажденные клетки 50 лейкоцитов промывают, суспендируют в питательной среде, обрабатывают конконавалином А, культивируют 16 ч и отделяют надосадочную жидкость, содержащую уинтерферон.55