Способ получения человеческого интерферона

с;,.А н и О П Е ЙЗОБРЕТЕНИЯ пц 460870 Союз СоветскихСоциалистических Республик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М. Кл. А 611 с 270 Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий) Авторыизобретен В, Д, Соловьев, Л. М. Менткевич,и В. П, Кузнецовпидемиологии и микробиологииАкадемии медицинских наук С Г, Орлова, Институт э(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРфЕРОНАаса к медициатов.ния чения км, инкуа ческого донора , выдеелов леток баци изводство сырьем -ая широко применя 1 рактичеокой медици сширить сырьеть целевого прод пользу пДля этого в качестве субс а исклетки костного мозга, вз го от пру а овека,П р и м е р, Заготовку клеток костного мозга проводят специализированной лабораторией, в которой параллельно заготавливают кровь л другие ткани при всестороннем медицинском контроле в течение первых 5 час после смерти.После общепринятой обработки операционного поля костный мозг берут стерильно из грудины, подвздошных костей и позвонков путем аспирации в стерильный шприц или методом промывания костей. Полученные клетки смешивают со средой 199 с 20% человеческой плазмы, содержащей 3 ед/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептоют чел Изобретение относится ется лекарственных препаИзвестен способ получ интерферона путем зараж вирусом интерфероногено ления и сбора интерферонОднако обеспечить про донорской кровью, котор ется во всех областях п ны, трудно.Цель изобретения - ра базу и повысить активнос мицина. Соотношение объема костного мозгаи консервирующей жидкости должно быть впределах 1: 2 - 1; 5,Клетки костного мозга, полученные из раз 5 ных костей одного трупа, объединяют вместеи хранят при 4 С до добавления вируса - интерфероногена. Время хранения не должнопревышать 72 час. За это время проводят основные медицинские контроли: определение10 содержания биллирубина в крови и патологоанатомический диагноз.При определении уровня биллирубина впределах нормы и при отсутствии противопоказаний к использованию трупного, костного15 мозга со стороны судебно-медицинского исследования собранные клетки используют дляпроизводства интерферона.Для получения интерферона по предлагаемому способу клетки костного мозга взвеши 20 вают в концент 1 рации 10 ядросодержащихклеток в 1 мл в среде 199, содержащей 5%плазмы (или сыворотки), 100 ед/мл пенициллина, 50 ед/мл стрептомицина, и к ним добавляют вирус - интерфероноген в количестве25 10 - 100 ТЦД 50 на одну ядросодержащуюклетку. Взвесь инкубируют при 37 С 2 час встационарном горизонтальном положении,Затем из взвеси клеток выделяют нагруженные вирусом ядросодержащие клетки, коЗО торые взвешивают в конценлрацпи 10 клеток460870 30 Предмет изобретения Составитель С. ЩеневаТехред Е. Борисова Корректор А. Васильева Редактор О. Стенина Заказ 881/12 Изд, Мц 387 Тираж 559 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 3на 1 мл среды 199, содержащей 5 - 10% плазмы (или сыворотки) и вышеуказанное количество антибиотиков, и инкубируют при 37 С 18 - 20 час, По окончании инкубации клетки отделяют центрифугированием при 1500 - 2000 д в течение 15 мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость повторно центрифугируют. К очищенной жидкости добавляют 10 - 20%-ный раствор соляной кислоты до рН 2,2 - 2,4 и выдерживают не менее 4 - 5 суток, при 4 С, после чего отбирают образцы для контроля. стерильности, токсичности и активности. Стерильность контролируют высевом 1 мл раствора на бульон с тиогликоллатом и бульон Сабуро. После 10 суток инкубации бульон с тиогликоллатом при 37 С и бульон Сабуро при 20 С посевы должны оставаться стерильными. Вирусологическую стерильность определяют введением по 0,2 мл жидкости в пробирки с 3-суточной культурой курицыных фибробластов и в аллантоисную полость 10- дневных куриных эмбрионов. Через 3 - 4 суток культивирования при 37 С при наблюдении под микроскопом в монослое клеток не должно быть признаков цитопатического действия, а аллантоисная жидкость не должна содержать гемагглютининов. Противовирусную ак- тивность раствора определяют по задержке цитопатического действия вируса везикулярного стоматита, взятого в дозе 100 ТЦДзе в пе 1 рвичной культуре клеток кожно-мышечной ткани 10 - 12-недельных эмбрионов человека или в перевиваемой культуре диплоидных клеток человека. Титр противовирусной активности должен составлять не менее 32 ед/мл в культуре фибробластов и не менее 250 ед/млв культуре диплоидных клеток. Определение токсичности проводят в монослойной культуре клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов че 4ловека, причем через 2 - 3 суток инкубации при 37 С не должно быть никаких признаков дегенерации монослоя, а морфология клеток должна оставаться неизменной,5 Весь цикл приготовления интерферона и егоконтроля занимает 14 - 20 дней. За это время получают результаты дополнительных исследований крови (реакция Вассермана и две осадочные реакции, посев крови на бактерио логическую стерильность). В случае отрицательных реакций полученный интерферон пропускают через молекулярные разделители (например, Сефадкс Г - 25 грубый), разливают в стерильные ампулы и замораживают при 15 температуре - 40. Затем из ампул откачивают воздух и подопревают до 30 - 35 С в течение 48 - 72 час. После высушивания ампулы запаивают под вакуумом, Остаточная влажность не должна превышать 4%, Готовую про дукцию вновь контролируют на безвредностьи вирусологическую стерильность, токсичность, а также безвредность путем внутрибрюшинного введения белым мышам весом 10 - 12 г по 0,5 мл раствора препарата. При 25 наблюдении в течение 5 суток мыши должныоставаться здоровыми. Кроме того, контролируют физические свойства: растворимость и остаточную влажность препарата. Способ получения человеческого интерферона путем заражения клеток вирусом интерфероногеном, инкубации с последующим выде лением, отличающийся тем, что, с цельюповышения активности целевого продукта и расширения сырьевой базы для его получения, в качестве субстрата используют клетки костюмного мозга, взятого от трупа человека.