Способ получения ксантиноксидазы

(55 С 12 й 9/О ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР: . ."Т г(А ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ О Од(71) Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А, Айтхожина(56) 1, Тгреп Е. Ю, Нао А, С. Моесоаг апб Яегоодса Согпрагзопз о 1 рогНеб Хап 1 Ьпе :)е)убгодепазез 1 гоп) Яоо( Мобоез о 1 Т)гее Огебе. - Ргобоспдедигпе пресез, Р)узоода Рапсагщп, 1988, ч, 74, ч". 1, р.164-168.2.Кильдибеков Н. А. Сравнительное исследование молибдокофактора нитрат-редуктазы бактероидов ЯигорМв ипи) и ксантиноксидазы молока. Дисс, канд. биол. наук. М,. 1983. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ксантиноксидазы (КО), и может быть использовано в инженерной энзимологии.Известен способ выделения КО (КДГ) из корневых клубеньков 3 видов бобовых - сои, вигны и фасоли Лима с использованием моноклональных Антител к КДГ сои Ц.Наиболее близким и изобретению по технической сущности является способ получения КО из животного источника - сливок, включающий отделение масла, фракционирование бутанолом, трехкратное высаливание сульфатом аммония, хроматографию на гидроксилапатите и гельфильтрацию 2).Недостатками известного способа являются необходимость свежевыделенных сливок из парного молока, трудоемкость(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСАНТИНОКСИДАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ксантиноксидазы, и может быть использовано в инженерной энзимологии. Цель изобретения - упрощение процесса и удешевление целевого продукта, Способ включает экстракцию зародышей зерна пшеницы буферным раствором, прогревание экстракта при 55-65 С в течение 5 мин, фракционирование сульфатом аммония и очистку методом ИОХ и ИЭФ. Степень очистки 1093, 1 табл. процесса отделения масла, длительное фракционирование (17 ч) бутанолом - токсичным органическим растворителем (сыворотка:бутанол 5:1), Для выделения КО по данному способу требуется от 4 до 5 дней,Целью изобретения является упрощение процесса и удешевление целевого продукта.Способ включает обработку исходного сырья и очистку продукта. причем в качестве исходного сырья используют зародыши пшеницы - отходы мукомольно-крупяного производства, которые обрабатывают буферным раствором, полученный экстракт прогревают при 55-65 С, а разделение бес- клеточного экстракта проводят методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе и изоэлектрофокусированием.1693047 25 Общий белок, мг Этапы очистки Удельная активность,ммоль/мин мг белкаСтепень очистки Общая активность, мкМ/мин 200 2,4 12 176 145 15 30 290 103 24 26 0,8 25,8 10,5 936 13125791093 Составитель А.СеменовРедактор О,Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор Т,Палий Заказ 4051 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-З 5, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101 П р и м е р. 10 г зародышей зерна пшеницы растирают в ступке в 50 мл 0,1 М Ка-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 10 мм восстановленного глутатиона, 10 мМ йагМо 04. Эту смесь центрифугируют при 12000 9 в течение 15 мин при 4 С. Бесклеточный экстракт прогревают от 55 до 65 С 5 мин, охлаждают до 15 С, Денатурированные балластные белки осаждают центрифугированием при 12000 9 в течение 10 мин при 4 С. Белки надосадочной жидкости после центрифугирования осаждают сульфатом аммония до 35 оь и центрифугируют. Осадок растворяют в 0,1 М трис-буфере, рН 8,2, и пропускают через сефадекс Сдля обессоливания, Фракции первого пика пропускают через ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и элюируют 0,2 М йаС. Фракции, обладающие КО активностью. подвергают препаративному изоэлектрофокусированию (ИЭФ). Экстракт зародышей Прогревание экстрактаВысаливание сульфатом аммония и ГПХ на сефадексе 6-25 Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозы ИЭФ Изоэлектрофокусирование ведут в градиенте концентрации сахарозы 5-50 О с1,5, амфолинов, рН 3-10. Размеры колонки1,6 х 30 см, напряжение 500 В, время 12 ч,5 температура 10 С, Полученный препаратэлектрофоретически гомогенен. Результатыочистки приведены в таблице,Следует особо отметить, что при прогревании активность КО зародышей пшеницы10 резко увеличивается,Формула изобретенияСпособ получения ксантиноксидазы,включающий экстракцию исходного сырья иочистку экстракта, о т л и ч а ю щ и й с я тем,15 что, с целью упрощения процесса и удешевления целевого продукта, в качестве исходного сырья используют зародыши зернапшеницы, которые экстрагируют буфернымраствором, содержащим соль молибдена,20 экстракт прогревают при 55-65 С и подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе иизоэлектрической фокусировки.