Способ получения билирубиноксидазы

(51)5 С 12 й 9/О 37/5 НИ ае 5 и:ИМЕЧКА тел ьскии ной про. Рыльцев 2 0 1/ хбатоп о 1 Вгев, Яос. БИЛ И РУБИ.биотехнолония фермен-лвел ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) 1. Патент СШАйг 4600689, кл. С 12 0 1/26, 19862. Патент СШАй. 4701111, кл. А 61 К 37/50, С1987.3, Уо 1 озМа О Епгуп)атс оЫгцЫп Ьу местпа в 0 соза. - .1.(57) Изобретение относитсягии. а именно к способу пол Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения фермента билирубиноксидазы, катализирующего окисление желчного пигмента - билирубиИзвестен способ получения билирубиноксидазы аэробной ферментацией штаммов грибов Тгас)убегп)а тзцпобае кл, Вазбогпусез на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, при рН 8-9 и 28-45 С в течение 72-96 ч с последующей очисткой культуральной жидкости хроматографией на ионообменных смолах и афинной хроматографией Ц та билирубиноксидазы, катализирующего окисление желчного пигмента - билирубина. Для увеличения выхода фермента, повышения его качества и стабильности в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, которое гомогениэируют в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04 ф, от массы сырья с последующим трехкратным осаждением ацетоном, высаливанием 6-8 М водным раствором хлористого натрия при 4-6 С в течение 10-12 ч и после растворения осадка диализом против воды. После сушки целевой продукт смешивают с 0,1-0,2глицина, Выход целевого продукта 0,8-1,2 от массы сырья, что в 16-24 раза превышает выход фермента в известном способе, при этом количество расщепляемого билирубина в крови увеличивает на 30-45, а стабильность фермента возрастает в 8,5 раз при хранении в условиях низких температур. 1 Недостатком способа является его длительность (около 6 сут), а также то обстоятельство, что получаемый фермент расщепляет не более 60 билирубина, что не позволяет гарантировать точность результатов количественного определения не- белкового азота и других компонентов в крови и моче.Известен способ получения билирубиноксидазы путем гомогенизации сырья - плодов высших растений семейств пасленовых и банановых, преимущественно бананов или баклажанов, в водной среде с последующей фильтрацией гомогената, осаждением фильтрата ацетоном, дополнительным растворением осадка в воде, пере 1693048осаждением из 70 -ного водного спирта и высушиванием целевого продукта (2.Недостатки известного способа заключаются в необходимости использования пищевого сырья, низком выходе фермента (0,08-0,1 от исходной массы сырья), невысокой его способности расщеплять билирубин (60-65 от содержания в анализируемой пробе) даже при высоких концентрациях (0,15-0,3 мг/мл) и низкой стабильности билирубиноксидазы при хранении (не более 20 сут при 4 С).Наиболее близким к предлагаемому является способ получения билирубиноксидазы из гомогената кишечника крыс, основанный на экстракции фермента водой с последующей очисткой фракционированием минеральными солями и органическими растворителями (3).Недостаток способа заключается в низкой активности фермента, выражающейся в его способности расщеплять лишь 40-50 билирубина, содержащегося в физиологических жидкостях организма, а также в нестойкости билирубиноксидазы (сохранение активности в течение 1-2 нед, в порошкообразном состоянии и в течение 2-4 ч в водном растворе),Целью изобретения является увеличение выхода фермента, повышение его качества и стабильности,Способ получения билирубиноксидазы предусматривает гомогенизацию сырья в водной среде, фильтрацию гомогената, обработку фильтрата ацетоном, дополнительное растворение осадка в воде и сушку, при этом в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, гомогенизацию проводят в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04 от массы сырья, осаждение ацетоном проводят трижды при 0 С, после растворения осадка в воде полученный раствор обрабатывают равным объемом 6-8 М водного раствора йаС при 4-6 С в течение 10-12 ч с последующим диализом раствора против воды. а после сушки целевой продукт смешивают с глицином в количестве 0,1-0,2 от массы целевого продукта.П р и м е р 1, 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают .на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г индуктора - эфедрина (0,02 фот массы сырья), смесь гомогенизируют 1 ч. затем фильтруют; фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С (3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0 С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды, раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденно 50 П р и м е р 3. 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,4 г индуктора - эфедрина (0,04 от массы сырья), 55 смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С (3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0 С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды.раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденно 1015202530354045 го до 0 С, через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще один раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массыисходного сырья и воды 1;1), фильтруют, к фильтратудобавляют равный объем 6 М водного раствора НаС и смесь выдерживают .при 40 С 10 ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуютпротив воды при 4 С 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 8 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,8 от исходной массы сырья), к которому добавляют 8 мгглицина (0,1 от массы целевого продукта), При добавлении к образцу крови с высокимсодержанием билирубина (более 20ммоль/л) фермента в концентрации 0,05 мг/мл происходит расщепление 85 били- рубина, Билирубиноксидаэа сохраняет активность при 4 С в течение 2-4 мес,П р и м е р 2. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,3 г индуктора - эфедрина (0,3 от массы сырья),смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С ( 3 объема от массы сырья),перемешивают, выдерживают при 0 С 4 ч,осадок отделяют, растворяют в 1 л воды,раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С, через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще один раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массы исходного сырья и воды 1:1), фильтруют, к фильтрату добавляют равный объем 7 М водного раствора йаС, смесь выдерживают при 5 С 11 ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против воды при 4 С 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 10 г порошка билирубиноксидазы (выход 1 от исходной массы сырья), к которому добавляют 15 мгглицина (0,15 от массы целевого продукта), При добавлении к образцу крови с высоьим содержанием билирубина (более 20ммоль/л) фермента в концентрации 0,075 мгlмл происходит расщепление 90 били- рубина. Билирубиноксидаза сохраняет активность при 4 С в течение 2-4 мес.го до ОС через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще раз, осадок растворяютв 1 л воды (отношение массы исходногосырья и воды 1:1), фильтруют, к фильтратудобавляют равный объему 8 М водного раствора 1 чаС, смесь выдерживают при 6 С 12ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против водыпри 4 С 16 ч, диализат сушат сублимациейи получают 12 г порошка билирубиноксидаэы (выход 1,2% от исходной массы сырья), ккоторому добавляют 10 мл глицина (0,2 отмассы целевого продукта), При добавлениик образцу крови с высоким содержаниембилирубина (более 20 ммоль/л) фермента в 15концентрации 0,1 мг/мл происходит расщепление 95% билирубина, Билирубиндксидаза сохраняет активность при 4 С втечение 2-4 мес.При изменении данной совокупности 20признаков положительный эффект не достигается, что подается следующими сравнител ьн ы ми п римерами.П р и м е р 4. 1 кг печени свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, 25в которой предварительно растворяют 0,2 гэфедрина, и далее поступают, как в примере1. Получают 9 г порошка, не обладающегоспособностью расщеплять билирубин в образцах крови даже в концентрации 0,1 30мг/мл,П р и м е р 5. 1 кг селезенки крупногорогатого скота измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина, и далее 35поступают, как в примере 1. Получают 8 гпорошка, при добавлении которого к образцу крови в концентрации 0,1 мл/мл не происходит расщепления билирубина.П р и м е р 6, 1 кг слизистой оболочки 40тонкого кишечника свиней измельчают наволчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,1 г эфедрина (0,01 оот массы сырья), и далеепоступают, как в примере 1. Получают 0,7 г 45порошка билирубиноксидазы (выход 0,07 о от массы исходного сырья), расщепляющей55 обилирубина в образцах крови при концентрации 0,15 мг/мл,50П р и м е р 7, 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают наволчке, к фаршу добавляют 2 л воды, вкоторой предварительно растворяют 0,2 гфенилаланина(0,02 оот массы сырья), и далее поступают, как в примере 1. Получают 1г порошка билирубиноксидазы (выход 0,1%от массы сырья), расщепляющей 65 обилирубина в образцах крови при концентрации0,2 мг/мл. П р и м е р 8, 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают наволчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой не растворяют индуктор, и далее поступают, как в примере 1, Получают 1 г порошкабилирубиноксидаэы (выход 0,1% от массысырья), расщепляющей 60 обилирубина вобразцах крови при концентрации 0,3мг/мл,П р и м е р 9. 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают наволчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина, смесь гомогенизируют 1 ч, затемфильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона,охлажденного до 0 С (3 объема к массесырья), перемешивают, выдерживают при0 С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 лводы, фильтруют, добавляют к фильтратуравный объем 6 М водного раствора ИаС 1 исмесь выдерживают при 4 С ч, Вследствиеналичия значительного количества липидовв осадке, который не подвергался дополнительному обезжириванию, как в примере 1,при высаливании осадок не образуется, чтоне позволяет выделить билирубиноксидазу,П р и м е р 10. 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают наволчке и далее поступают, как в примере 1,за исключением того, что фильтрат, получаемый после фильтрации гомогената, обрабатывают этиловым спиртом. Получают 0,5г порошка билирубиноксидаэы (выход0,05%от исходной массы сырья), расщепляющей 35 билирубина в образцах кровипри концентрации 0,15 мг/мл,П р и м е р 11. 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают наволчке и далее поступают, как в примере 1,за исключением того, что осадок после переосаждения из ацетона растворяют в водеи сушат сублимацией, минуя стадию диализа против воды, Получают 18 г порошка, необладающего активностью билирубиноксидазы даже при концентрации 0,3 мг/мл вобразцах крови.П р и м е р 12. 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают наволчке и далее поступают, как в примере 1,за исключением того, что к 8 г порошка билирубиноксидаэы (выход 0,8 О/ от массысырья) добавляют 4 мг глицина (0,05 оотмассы порошка), При этом фермент сохраняет активность при 4 С в течение 15 сут.П р и м е р 13, 1 кг слизистой оболочкитонкого кишечника свиней измельчают наволчке и далее поступают, как в примере 1,эа исключением того, что к 8 г полученногопорошка билирубиноксидазы (выход 0,8%от исходной массы сырья) не добавляют стаКорректор Т,Палий Заказ 4051 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 билизатор. При этом фермент сохраняет активность при 4 С в течение 8 сут.П р и м е р 14, 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что к 8 г полученного порошка билирубиноксидазы (выход 0,8 от исходной массы сырья) добавляют в качестве стабилизатора 8 мг глюкозы (0,1 от массы порошка). При этом фермент сохраняет свою активность при 4 С в течение 14 сут.Предлагаемый способ получения билирубиноксидазы по сравнению с известным способом позволяет повысить выход фермента в 16-24 раза, увеличить количество расщепляемого билирубина в крови на 30- 45 при концентрации фермента, добавляемого в кровь, в 10 раэ меньшей, а также в 8,5 раз увеличить его стабильность при хранении в условиях низких температур. Формула изобретения 1. Способ получения билирубиноксидазы, предусматривающий гомогенизацию кишечника млекопитающих в водной среде, 5 фильтрацию гомогената, высаливание с последующим растворением осадка в воде и сушку, отличающийся тем,что,сцелью увеличения выхода фермента, повышение его качества и стабильности, в качестве 10 сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, гомогенизацию проводят в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04 от массы сырья, перед высаливанием проводят трехкратное 15 осаждение ацетоном, высаливание осуществляют 6-8 М водным раствором хлористого натрия при 4-6 С в течение 10-12 ч, а после растворения осадка проводят диализ против воды.20 2, Способ по п,1, отл и ч а ю щи й с ятем, что после сушки целевой продукт смешивают с 0,1-0,2 глицина.