Способ выделения ферредоксина

ОЮЗ СОВЕТСНИХОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 9) (И) А 61 К 35/ ИСАНИ ЗО ЕНИ ВРДЕТЕЛЬСТВУ и о А.,и исслефотосино, 1973.ЕРРЕДОКСИ.ительовнчатого СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ(71) Институт почвоведениясинтеза АН СССР(54)(57) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФНА путем гомогенизации растного сырья, экстракции белктрис-буфером, отжима, ступевысаливания сульфатом аммон центрифугирования, суспендирования обессоливания на сефадексе= 50, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлоэа с элюцией хлористым натрием и последующей гельфильтрации на сефадексе= 50, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения выхода и степени очистки целевого продукт в качестве источника сырья используют листья кукурузы на стадии образования початков, в трис-буфер добавляют аскорбат натрия 5-7 г/л, диэтилдитиокарбамат натрия 0,4- 0,6 г/л и поливинилпирролидон 2-3 а элюцию проводят 0,15-0,18 М хлористым натрием.Изобретение относится к биохимии фотосинтеза, а именно к способам выделения белков, играющих ключевую роль в окислительно-восстановительных процессах при фотосинтезе, и может быть использовано для биохимичес-. ких исследований.Цель изобретения - повышение выхода и степени очистки целевого продукта.П р и м е р, 1 кг листьев кукурузы, срезанных на стадии образования початков и хранившихся при -30 , заливают жидким йэотом, меоханически размельчают в двухслойном бязевом мешке, заливают 1,3 л 0,005 М НС буфером с защитными добавками, г:Аскорбатнатрия 5,3Диэтилдитиокарбамат, 0,5 (1000 мл)Поливинилпирролидон 2,5Экстракт отжимают. К 1,5 л экстракта добавляют 495 г сульфата аммония марки х.ч. или о.с.ч. Через 0,5 ч центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об/мин, Осадок отбрасывают, а к 1,8 л супернатанта добавляют 450 г сульфата аммония. Через 1,5-2 ч производят центрифугирование как и в первом. случае. Ферредоксин (Фд), находящийся в осадке, растворяют в 75 мл 0,05 И трис НС буфера, рН 7.8. При 14000 об/мин в течение 10 мин центрифугированием освобождают раствор белка от не- Растворившихся примесей. Для обессоливания наносят прозрачный раствор неочищенного Фд на предварительно уравновешенную 0,005 М трис НС 1 буфером, рН 7,8 колонку с сефадексом Ссредний (диаметр 2 см, высота 75 см), окрашенный в коричневый 94422 2.цвет Фд вместе с пластоцианином собирают отд льной фракцией. Наносятее на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой,(элюируется Фд) .Окрашенный в синий цвет при добавлении феррицианида калия пласто 15 цианин концентрируют на ДЭАЭ-целлюлозе (диаметр 1 см, высота 2,5 см),предварительно понизив ионную силураствора раэбавлением 0,005 Мтрис НС 7 буфером в 2-3 раза.20 Элюат Фд, окрашенный в коричневый цвет, концентрируют на ДЭАЭцеллюлозе (диаметр колонки 1 см,высота 2 см). Снимают концентрированный Фд 0,17 М трис НС буфером25 с 0,55 М НаС 1. ХроматограФией насефадексе Ссверхтонкий существенно очищают от примесей белкови сопутствующей .бурой окраски, Повторная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозеЗ 0 и сефадексе Ссверхтонкий позволяет получить Фд с предельным ко-,эффициентом ф 0,44 служащимя1 гавкритерием чистоты для фд кукурузы.Препаративный форез после 1-.йСсверхтонкий позволяет получитьбелок с 0,44 красно-коричневогоАах4 О 8цвета. Выход белка при этом 45 мг.Схематически выделение и очисткуФд можно представить следующим образом.Схема получения .ферредоксинакукурузы из листьев 12-недельныхрастений:0,17 И трис НСФ0,08 М МаСД ДЭАЭ-ц - пластоцианин Фд ДЭАЗ- ц концентрационная .0,017 М трис НС 1 0,55 М ЯаС 2 С - 50 сверхт.Д.ЭАЭ-ц 0,17 М трис НС 10,18 ИаС 1 ДЭАЭ-ц концентрационная0,17 М трис НСФ0,55 М ИаСФ0-50 сверхтонкий Составитель Н.ГуляеваРедактор Т.Митейко ТехредО.Неце Корректор, М, Самборская Заказ 7342/7 Тираж 721 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5.филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Все процедуры очистки. можно проводить при комнатной температуре. Выделенный таким способом Фд сохраняет устойчивость в течение 2-3 лет. Выделение фд из листьев кукурузы на стадии образования початков по той же схеме, что и в при мере 1, но без защитных добавокснижает выход белка в 1,5-2 раза.