Способ определения лизосомальной активности лейкоцитов на мазках

.й"- с: И итутухарев гии реицина,ИЗОСО- ЦИТОВ ицийе, а ется пося кме лью явл ляется повышечет исключения ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Челябинский медицинский инс(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛМАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКНА МАЗКАХ(57) Изобретение относит дименно к иммунологии. Це Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов,Целью изобретения явние точности способа за ссвечения ядер.Способ осуществляется следующим образом.Берут плазму, обогащенную лейкоцитами в концентрации 10 клеток в 1 мл, из отстоявшейся в течение 60-90 мин при температуре 37 С венозной гепариниэирован-. ной крови. Далее смешивают взвесь клеток со средой 199 в соотношении 0,05:1 и наносят ее на покровное стекло, помещенное в пластиковую чашку Петри. Инкубируют при 3 С в течение 60 мин чашки Петри, после чего неприлипшие клетки удаляют путем промывания средой 199, на стекле остается только монослбй адгезированных клеток. На стекле с монослоем лейкоцитов наносят раствор акридинового оранжевого красителя в среде 199 в конечной концентрации 4,0 мкг/мл и выдерживают препарат 60 мин при вышение точности способа за счет исключения побочного свечения ядер. Цель достигается тем, что при окрашивании применяют акридиновый оранжевый в концентрации 3,8-4 мкг/мл, при этом красят в течение 60- 90 мин при температуре 37 С. Облучение препаратов проводят ультрафиолетовым светом в диапазоне 300-500 нм, при этом активность определяют при возбуждающем свечении в диапазоне 635-645 нм, Способ позволяет значительно повысить точность определения лизосомальной активности в лейкоцитах за счет исключения побочного свечения ядерного вещества,37 С. После инкубации стекло с клеткамитрижды отмывают от акридиноваго оранжевого красителя средой 199, а затем помещают на предметное стекло клетками вниз, удалив избыток влаги фильтровальной бумагой, Клетки облучают возбужденным люминесцентным свечением в диапазоне . 300-500 нм, используя для этой цели лампу д накаливания с иодным циклом КГМ 9-70 и светофильтрами ССи БС. Далее осуществляют микрофлюориметрическую регист-рацию результатов, для чего применяют ФМЭЛ с интерференционным светофильт ф ром 15, выделяющим возбуждаемое свече ние в диапазоне 635-645 нм. ьПроводят флюориметрию лизосомального свечения 100 клеток, результат записы- ф вают с помощью самописца Н-1. Определяют средний показатель свечения лизосом одного лейкоцита, При значениях средней активности лиэосом меньше 1,77 й +0,46 В определяют снижение лизосомальной активности лейкоцитов, а при значениях этого показателя выше 1,780,46 - усиление активности лиэосом.1682864 Составитель Л, СтебаеваТехред М,МОргентал Корректор Т. Палий Редактор А. Мотыль Заказ 34.06 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственнсго комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-иэда;ельский комбинат Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Подбор конценграций акридинового оранжевого, а также Определенных светофильтров при облучении объекта позволяет исключить полностьо свечение ядер, что улучшает люминесценцию лизосом в цитоп лазме, делает более чистым фон, позволяет исключить побочное свечение.П р и м е р 1. Из крови получали плазму. Брали плазму с клетками в концентрации 10 /мл из отстоявшейся в течение 60 мин 106веноэной гепариниэированной крови, Далее готовили монослой клет и на покровном стекле в соответствии с общепринятой методикой. Инкубировали монослой в среде 199, содержащей акридиновый оранжевый 15 в конечной концентрации 4,0 мкгlмл в течение 60 мин. Трижды промытое стекло с клетками помещают на предметное стеклс и удаляют избытОк Влаги фильтрОВальной бумагой. 20Готовый препарат исследуют при люминесцентной микроскопии.Лолучили следующие значения лизосомальной активности у донора А, Они Оавны 1,69 в, что свидетельствует О нормальной 25 лизосомальной активности лейкоцитов у данного человека,Таким образом, предложенный способ позволяет получитьточные результаты с лизосомальной активности лейкоцитов, Снижение побочного свечения в клетках также создает чистый фон вокруг лиэосом, что позволяет исключить потери в активности при ее количественном учете,Формула изобретения Способ определения лиэосомальной активности лейкоцитов на мазках путем их Окрашиванил растВором акридинОВОгО оранжевого с последующим облучением и оценкой активности по величине возбужденного свечения, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет исключения свечения ядер, окрашивание проводят акридиновым оранжевым в концентрации 3 8-4 мкмл в течение 60-90 мин при температуре 37 С, а облучение проводят ультрафиолетовым светом в диапазоне 300-500 нм, при этом активность определяют при Возбужденном свечении в диапазоне 635-645 нм.