Способ определения активности моноаминооксидазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЯО 1521761 А 1(51) 4 С 12 О 1/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2(57) Изобретение относится к способам определения Ферментативной активности биологических препаратов и может быть применено в медицине, биохимии и Фармакологии. Целью изобретения является упрощение, ускорение и повышение чувствительности способа. К водной среде измерения, содержащей субстрат моноаминооксидазы (МАО) дециламин, а также бактериальную люциферазу и ее субстратыдобавляют анализируемый препарат МАО и на люминометре измеряют биолюминесценцию, по уровню нарастания которой судят об активности моноаминооксидазы. Способ позволяет измерять ферментативную активность до 40 пмоль субстрата в 1 мин в пробе,(21) 4275)24/31-13(56) Волковицкая О.Э Бочев П.Г.,Рибаров С.Р Горкин В.З., Коган В,Е,Исследование моноаминоксидазной активности митохондрий плаценты человекаметодом хемилюминесценции. - Вопросымедицинской химии, 1986, т. 32, У 5,с. 77-79,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИМОНОАМИНООКСИДАЗЫ,дециламнн 5-50 мкМ, после чего в кювету добавляют бактериальную люцифе- Щ разу до конечной концентрации 10- Фаа 1 100 мкг/мл. и препарат моноаминооксидазы (МАО). Затем за 10-60 с регистри- а руют скорость нарастания биолюмине 9 иай сценции, по которой судят об активности анализируемого препарата МАО. Из. мерения проводят на люминометре прио25 С. Скорость выражают в усл.ед/с.Предварительно в идентичных условиях строят калибровочную зависимость скорости нарастания биолюминесценции от количества в пробе стандартного препарата МАО с известной активностью, измеренной независимым способом, которую используют для выражения активности анализируемого препарата МАО в Изобретение относится к способам определения ферментативной активности биологических препаратов и может быть применено в медицине, биохимии и фармакологии.Цель изобретения - упрощение, ускорение и повышение чувствительности способа.Способ осуществляют ,следующим образом.В люминометрическую кювету вносят 0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 34-62 мм, калий Фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38-66 мм, рН 7,0-7.,5, Флавинмононуклеотид (ФМН) 10-40 мкМ, никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАДН) 0,4-1 мМ, 1521761 4абсолютных единицах (наномоль субстрата в минуту на мг белка).П р и м е р 1. В измерительную кювету люминометра вносят 0,5 мл вод" ной смеси следующего состава:калий фосфорнокислый однозамещенный 62 мМ, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38 мМ, рН 7,0 ФМН 10 мкИ, НЛДН 0,4 мМ, дециламин 5 мкМ, добавляют бактериальную люциферазу в концентрации 10 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий из мозга крысы в концентрации 100 мкг/мп, Помещают кювету в люминометр и при 25 С изме 15 ряют скорость нарастания биолюминесценции за 10 с, которая составляет 0.,31 усл, ед./с. Определенное по калибровочной зависимости значение активности следует умножить на 10 (коэффициент, учитывающий в 10 раз меньшее по сравнению с калибровочнои прямой количество люциферазы, взятое для проведения анализа), что дает моноаминооксидазную активность анализи руемого препарата митохондрий 10 нмоль/мин на мг белка.П р и м е р 2. В измерительную кювету люминометра вносят 0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 34 мИ,30 калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный бб мМ, рН 7,5, ФМН 40 мкМ, НАДН 1 мМ, дециламин 50 мкМ, добавляют бактериальную люциферазу 100 мкг/мл и анализируемый препарат тромбоцитов 35 из крови человека в концентрации 100 мкг/мл. Помещают кювету в люминоометр и при 25 С измеряют скорость нарастания биолюминесценции эа 60 с, которая составляет 0,27 усл.ед./с. По40 калибровочной зависимости, полученной со стандартным препаратом МАО, определяют моноаминооксидазную активность тромбоцитов из крови человека, которая составляет 0,8 нмоль/мин на мг белка.П р и м е р 3Все операции .выполняют аналогично примеру Т; однако используют водную среду измерения сле", дующего состава: калий фосфорнокислый Я одноэамещенный 45 мИ, калий фосфорно- кислый двузамещенный трехводный 55 мМ,рН 7,2, ФМН 10 мкМ, НАДН 1 мМ, дециламин 20 мкМ, и в измерительную кювету вносят бактериальную люциферазу 55 в конечной концентрации 100 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий иэ мозга крысы в концентрации 10 мкг/мл., Измеренная скорость нарастания биолюминесценции составляет0,31 усл.ед./с, что соответствует монооксидазной активности 10 нмоль/минна мг белка.П р и м е р 4, Все операции проводят аналогично примеру 1, но используют водную среду измерения следующегосостава: калий фосфорнокислый однозамещенный 62 мМ, калий фосфорнокислыйдвузамещенный трехводный 38 мИ, рН7,0, ФМН 1 мкИ, НАНД 0,04 мМ, дециламин 0,5 мкМ. В кювету добавляют бактериальную люциферазу в конечной концентрации 100 мкг/мл и анализируемыйпрепарат митохондрий из мозга крысыв концентрации 100 мкг/мл. Нарастаниябиолюминесценции наблюдать не удается. Таким образом, выход за диапазоноптимальных концентраций компонентовреакционной смеси в сторону уменьше-.ния делает невозможным определениеактивности МАО,П р и м е р 5. Все.операции проводят аналогично примеру 2, но используют концентрации дециламина 400 мкМ,калий-фосфатный буфер О, 1 М, рН 8,0,Концентрации остальных компонентовоставлены без изменения. Нарастаниябиолюминесценции не наблюдают.7 аким образом, выход за диапазоноптимальных концентраций реагентовв сторону увеличения делает невозможным определение моноаминооксидазнойактивности.Формула изобретенияСпособ определения активности моноаминооксидазы путем добавления ферментного препарата моноаминооксидаэы в водную буфернуюреакционную смесь,содержащую субстраты данного фермента, вспомогательный фермент, вызывающий хемилюминесценцию при взаимодействии с продуктами моноаминооксидазной реакции, и субстраты вспомогательного фермента с последующей оценкой активности моноаминооксидазы по скорости нарастания хемилюминесценциио т, -л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения, ускорения и повышения чувствительности способа, используют вод ную реакционную смесь, содержащую 0,1 М калий фосфатный буфер рН 7,0- 7,5, флавинмононуклеотид 10-40 мкМ, никотинамидадениндинуклеотид восстановленный 0,4-1,0 мМ, дециламин 5-50 мкМ и бактериальную люциферазу 10-100 мкг/мл.