Способ определения субпопуляций лимфоцитов

)4 3 57 О ЛЬСТ Я СУБПОПУЛЯЦК 3 Изобретение отно ци- иммуя к рок- ет- и завор ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕК АВТОРСКОМУ СВИ(56) Рукосуев В.С, Варианты иммунопероксидазного метода исследования,Арх.анат.гистол. и эмбриолог.,1979,т.ТХХЧ 1, У 2, с. 62-66(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в имму не и может быть использовано в нологии.Цель изобретения - упрощение способа и повьппение его информативности.П р и м е р 1. Мазки иэ капли крови, смешанной с гепарином, взятой из пальца больного в объемном соотношении 1:1 О (гепарин 5000 ед. в .1 мл) исследуются для уточнения варианта лимфобластного лейкоза.Мазки сушили в течение 6 ч на воздухе при комнатной температуре, завернули в алюминиевую фольгу, заморозили и хранили в холодильной установке при -18 фС в течение 19 ч. Затем препараты довели до комнатной температуры в течение 5 мин, сняли фольгу30 с фиксировали в формол-ацетоне при рН 6,6, промыли в трех сменах буференного физиологического растнологии. Целью изобретения являетсяупрощение и повышение информативности способа определения субпопуляцийлимфоцитов с помощью моноклональныхантител. Способ осуществляется путемпроведения двойного варианта иммуноцитохимического ПАП-окрашивания мазков периферической крови или мазковиз лейкоконцентрата веноэной кровипутем высушивания, замораживания,доведения до комнатной температуры,фиксации в формол-ацетоне,ингибнрования активности эндогенной пероксидаэы. Популяция лимфоцитов определяется при светооптической микроскопиипо коричневому ободку в цитоплазме. Провели двойной вариант окрашивания по схеме: первичные моноклональные антитела 1 час, связующая сыворотка 30 мин, ПАП комплекс (пероксидазамоноклональные антитела к пероксидаэе) 30 мин, связующая сыворотка 15 мин, ПАП комплекс 15 мин. Каждый реагент наносили на стекло в пределах очерченного стеклографом круга в количестве 0,02 мл. В качестве моноклональных антител использовали: ИКО, ИКО; Л, с ОЛЛ, ИКО, Все этапы инкубации шпи при комнатной температуре во влажной камере.После каждого из них стекла промывали в эабуренном физиологическом растворе. Затем выявили активность пе сидазы: 5 мг 3,3 -диаминбеэодин т рахпорида растворили в 1 О мл ЗФР добавили 0,02 мл ЗХ-ного раствора перекиси водорода, мазки инкубировали в течение 3 мин. Ядра клеток до1492286 Реакцию МКАТ к лимфоцитам определяли по коричневому ободку в цитоплаэме. Составитель А.Чирков Техред Л.ОлийныкРедактор И,Горная Корректор В,Гирняк Заказ 3871/47 Тираж 789 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГЕНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 красили 2 -ным раствором метиленового зеленого в течение 3 мин.Реакцию лимфоцита с МКАТ определили по коричневому ободку в цитоплаэ 5ме.Получены результаиы: 60 ИКО 19 ИКО +1 ф; 6% ИКО, 39% сОПП; 39 , ПТНа основании полученных данныхуточнен диагноз больного: 3-острыйлимфобластный лейкоз общего типа.П р и м е р 2. Для определениясубпопуляций лимфоцитов донора приготовили мазки иэ лекоконцентрата,высушили на воздухе 6 ч, заморозилиои хранили в холодильнике при -20 Св течение 4 дней,Затем препараты довели до комнатной температуры в течение 20 мин,сняли фольгу, 30 с фиксировали в формолацетоне при рН 6,9, промыли в трехсменах ЗФР, провели двойной вариантПАП окрашивания, В качестве первичных мононуклеарных антител использовали ЛТ. Все планы осуществлялисьпри комнатной температуре во влажнойкамере, мазки после инкубации накаждом этапе промьвали в ЗФР, Ядраклеток докрасили 2 ,-ным растворомметиленового зеленого,Формула и зобретенияСпособ определения субпопуляцийлимфоцитов с помощью моноклональныхантител путем приготовления цитологического препарата и проведения иммуноцитохимического окрашивания ПАПметодом, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения способаи повышения его информативности,исследование проводят в мазках периферической крови или в мазках из лейкоконцентрата венозной крови,приготовленных посредством добавления антикоагулянта в объемном соотношенииантикоагулянт:кровь = 1:10, высушивания, замораживания при -18-20 еС,последующего доведения до комнатнойтемпературы в течение 5-20 мин, фиксации в формол-ацетоне при рН 6,6-6,9в течение 30-45 с, ингибирования активности эндогенной пероксидазы3%-ным раствором перекиси водородав течение 3-5 мин, проведения двойного варианта ПАП-окрашивания и определения субпопуляций лимфоцитовпо морфологическим признакам,