Способ определения состояния фибринолитической системы крови

(51) БРЕТЕНИЯ ЕЛЬСТВ тненныи меди нинского ком б етение о о бедную мн быч тромбоцитамимальной конта ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕК АВТОРСКОМУ СВИ(71) Алтайский государсципский институт им. Лесомола(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯФИБРИНОЛИТИЧЕСКО 11 СИСТЕМЫ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине,а именно к лабораторным функциональным,методам диагностики нарушенийФ Изо р тносится к медицине, а именно к области лабораторных методов диагностики нарушений системы гемостаза, в частности фибринолиза.Из известных способов исследования фибринолиза наиболее близким по технической сущности является мет д исследования Х 11 а-калликреин-зависимого лизиса по Г.Ф,Еремину и А,Г.Архипову. Для его осуществления используют следукщие реактивы; 3,8% - ный раствор цитрата натрия,1%-ная уксусная кислота, буфер Михаэлиса (рН 7,4- 7,6), суспензия каолина (5 мг/мл) 0,277%-ный раствор хлорида кал,шя, дистиллированная вода.Ход определения: плучаютплаэму н ;ел.ктной;ктинапи 2гемостаза, в частности фибринолиэа Целью изобретения является повышение точности. способа. Способ заключается в том, что исследуемую плазму дефибринируют, затем подучаэт эуглобулины, не содержащие фибриногена и лишенные активности С,-игибитора и актинируют их каолином. Определение времени лизиса ведут при добавлении к контрольным эуглобулинам активирова ных эуглобулинон из дефибриниронанной плазмь, Удлинение нремени лизнса более 45 мин свидетельствует о депрессии фибринолиза, а укорочение менее 35 мин - об активации фибрис за, При тррмбозах и синдромах ДВС время лизиса часто удлиняется до 70-80 мин. 5 табл. ным способом. В процессе выделенияэуглобулиновой фракции, фактор ХГГподвергают контактной активации ка- лином, образуется комплекс ф.Х 11 авысокомолекулярной кининоген-прекалликреин, который активирует плазминоген. Полученные эуглобулины, содержащие плазмин, растворяют н бу- ОО фере Михаэлиса, и сразу после доб;- 3 лення хлорида кальция засекат вренн по секундомеру. В норме полшй лпзис происходит за 4-12 мин. Задерж, лизиса свидетельствует .о недостатности внутреннего Х 11 а-занисимог- 3 ь ханизма фибринолиза,Цель изобретения - повышениености способа. Цель достигается тем, что нбе оценки фибринолиэа, вк:.получение активированных каолином эуглобулинов, активированные эуглобулины получают иэ исследуемой плазмы после ее дефибринации при 56-57 Со в течение 5-10 мин, затем определяют1 з фибринолитическую активность смеси растворенных активированных эуглобулинов исследуемого и неактивированных каолином эуглобулинов, полученных из пула плазм здоровых людей, взятых в равных количествах, вызывая образование сгустка добавлением хлорида кальция, причем при. времени лиэиса свыше 45 мин диагностируют депрессию фибринолиза, а при времени лизиса менее 35 мин - актнвацию фибринолиза. 15 45 Способ осуществляют следующимобразом.20Реактины используют те же, что ив известном способе.Бедную тромбоцитами плазму, полученную в условиях минимальной контактной активации, прогреваит в течение 5-10 мин при 56-57 С, затемцентрифугируют при 1200-1400 р н течение 15 мин. Осадок удаляют. Полученный дефибринат инкубируют с каолином при разведении в 16 раз н кислой среде (рН 5,0). Это приводит квыпадению эуглобулинов, содержащихплазмин. Смесь центрифугируит при400 В в течение 6 мин, надосадочнуижидкость сливают и растворяют осадок35в буфере Михаэлиса (количество буфераравно количеству взятого дефибрината).В качестве субстрата используитэуглобулины из пула плазм 1 О здоровых людей, полученные обычным способом (по Коыагкд 1 с): 0,5 мл плазмывносят н 8,0 мл дистиллированной воды с 0,18 мл 1 Х-ной уксусной кислоты,смесь пикубируит 30 мин при 4 С иоцентрж.угируит при 400 я в течение6 мин. Надосадочную жидкость сливают, а эуглобулины растноряит в 0,5 млбуфера Михаэлиса.Берут 0,25 мл активированных эуглобулинов из дефибриронаииой плазмы исследуемого и 0,25 мл субстрата,смешинаит их в водной пробирке,смесь свертынаит 0,5 мл СаС 1(02777) и включают секундомер., Засекается время лиэиса образовавшего 55ся сгустка, Исследование проводитсяона.водяной бане при 37 С.У здоровых людей полный лизис происходит за 35-45 мин, Удлинение нремени лизиса свидетельствует о снижении фибринолитической активности плазмы, Так, при тромбозах и синдромах ДВС время лизиса часто удлиняется до 70-80 мин.Клиническая апробация способа оценки фибрииолиза была проведена у 14 здоровых людей у 9 больных с массивными ненозными тромбозами у 6 больных с синдромом ЛВС.Результаты представлены в табл.1.Иэ представленных данных видно что при тромбоэах и синдромах ДВС нремя лизиса удлиняется в 1,5 раза, во всех случаях время лизиса превышает 45 мин (М + 2 о).Для ныяснения воэможности регистрации актинации фибринолиза проведена серия экспериментов с добавлением разных концентраций стрептокиназы в плазму (препарат фирмы ЧЕВ АВЕЛЕМТТЕЬИЕКХ РКЕЯПЕИ "Аые 1 уа 1 п"). Использовались концентрации стрептокиназы, применяемые для лечения больных с тромбоэами.Результаты (средние данные иэ трех серий экспериментов) приведены н табл.2.Иэ представленных н табл.2 данных видно, что исследование фибринолиза предлагаемым способом позволяет выявить степень . активации фибринолиза, время лиэиса менее 35 мин (М+24) тогда как исследование по известному способу в этих условиях невозможно.Для определения оптимального режима прогревания с целью последующего исследования фибринолиза приведена серия экспериментов по определении зависимости времени лизиса по предлагаемому способу у здороных людей от температуры и времени дефибринации плазмы.Результаты представлены в табл.3,Из табл. 3 видно, что оптимальное время дефибринации для предлагаемого способа 5-10 мин при 56-57 С. Дальнейшее прогревание приводит к значительному удлинению времени лиэиса,П р и м е р 1. Больной В 35 лет. Диагноз: хронический миелолейкоз терминальная стадия, ДВС-синдром, гематома нижней трети правой голени. Результаты лабораторного исследования системы гемостаза; аутокоагуляци. онный тест (АКТ) на 10 мин - 1 Ос; каолин-кефалиноное время свертывания (ККВС) 47 с (контроль 47 с);1492287 25 Время лиэиса мин Больные 0,662,02,9 Таблица 2 Время лизиса, мин, при добавлениистрептокиназы в доза, ед/мл Способ Времялизиса,на контроле,мин 1 О 50 70 00 300 30 20 . 15 9 6 ПредлагаемыйИзвестный СгусСгус- Сгусток ток не не об-обрараэо- зовался вался Сгус- Сгусток не ток не образо-обравался эовалток необразовался ся протромбиновое время 23 с (контроль 17 с); тромбиновое время 14 с (контроль 15 с); этаноловый тест положительный; протаминсульфатный тест положительный.Изменения компонентов системы гемостаза, участвующих в Функционировании Фибринолиза представлены в табл.4.Иэ табл,4 видно, что время лиэиса в известном способе и предлагаемом удлинено вследствие снижения количества плазминогена, ВМК и ПК. Количество Фибриногена у больного было нормальным. В данном случае результаты исследования по предлагаемому способу и .известном совпадают. Вместе с тем, удлинение времени лизиса по известному способу на 2300,. не О адекватно, так как явно превышает во много раз степень снижения основных компонентов, принимающих участие в регуляции фибринолиэа, Нарушение фибринолиза, выявленное с помощью предлагаемого способа, соответствует степени снижения этих компонентов.П р и м е р 2. БольнаяИ, 65 лет. Диагноз: правосторонний илеофеморальный тромбоз.30Результаты лаборатс рного исследования систем гемостаэа: АКТ на 1 О мин 8 с, ККВС 40 с (контроль 46 с) протромбиновое время 8 с,(контроль 17 с), тромбиновое время 14 с (конт 35 роль 16 с), этаноловый тест положительный, протаминсульфатный тест положительный.Изменения компонентов системы гемостаза, участвующих в функциони О ровании Фибринолиза, приведены в табл.5. В данном случае удлинение времени лизиса по известному способу было ложным и обусловлено гиперфибриногенемией. Определение Фибринолиза предлагаемым способом не выявило его нарушения, что соответствовало нормальному содержанию ВМК ПК и плазминогена. Формула и э о б р е т е н и я Способ определения состояния, фибринолитической системы крови путем получения плазмы крови, обработки ее каолином, отделением эуглобулиновой фракции, добавления к ней раствора хлористого кальция и регистрации времени лиэиса образовавшего" ся сгустка, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, плазму предварительно нагревают в течение 5-10 мин при 56- 57 С, перед добавлением хлористого кальция эуглобулиновую Фракцию смешивают в соотношении 1:1 с фракцией эуглобулинов, неактивированных каолином и полученных из плазмы крови доноров, при этом при времени лизиса сгустка менее 35 мин определяют активацию, а более 45 мин - депрессию Фибринолитической системы.Таблица Здоровые 40,3 2,46 С тромбоэами 696 6,1 С синдромом ДВС 71,0 8,21492287 Т а б л и ц а 3 Время лизиса при времени прогревания 1 мин 5 1 О гО 41 42 72101 124 147 Показатель Значения показателей У боль- Контроль, ,Процентного В.В. мин сдвига,7мин 2300 120 86 40,3 71 0,214 0,530 60 82 59 34 100 74 2,9 3,4 3,5 Значения показателей Показатель У больной Контроль, Процент11.Емин мин сдвига,7 490 24 Время лизиса попредлагаемому способу 38 ВМК, мкг/мл 0,43556-57 59-60 Время лизиса поизвестному способу Время лизиса попредлагаемомуспособу Высокомолекулярный кининоген, ВМК Плазменный прекалликреин, ПК,мкМольВАИЗ/л/мин Резерв плазминоге" на, 7. КолиЧество фибриногена, г/л Время лизиса по известному спо- собу Резерв ппазмииогена,Е Т а б л и ц а 4 Таблица 5 40,3 40,530 1982 43