Способ определения концентрации общего тиамина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЯО 1465762(54) С ОБЩЕГО (57) И биохим гии, и ОСО относится к области обретени и, в час может бы ости к витаминолоиспользовано приГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯПРИ ГКНТ СССР Изобретение относится к биохимии, в частности к витаминологии, и может быть использовано при определении количественного содержания тиамина в биологических материалах, в витаминных препаратах, продуктах питания и кормах.Цель изобретения - увеличение чув" ствительности и точности способа.П р и м е р 1. Инкубационную среду, содержащую 0,7 мл фосфатного буфера 0,2 М, с рН 6,0-7,0; 0,075 мл никотинамида; 0,025 мл меченного тиамина по тиазолу " С 1 и 0,1 мл анализируемой пробы, помещают в емкостьо со льдом и водой и охлаждают до 0-4 С. После охлаждения среды до указанной температуры, с целью проведения ферментативной реакции в инкубационную среду вносят фермент тиаминазу 1 в объеме 0,1 мл, полученный из мышц пресноводных двустворчатых моллюсков Аподопйа сувпеа, и проводят,инкубацию определении количественно ния тиамина в биологическ лах, в витаминных препаратах, продуктах питания и кормах. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Для этогоготовят стандартный образец тиамина,меченного по С , и исследуемую про 1бу вводят в них специфический реагент-тиаминазу 1, инкубируют при0-4 С с образованием каталитическихпродуктов и последующим сопоставлением их концентраций,2среды в течение 1 мин при 0 С. Ферментатцвная реакция сопровождается увеличением скорости образования продукта реакции 1 С 1 - тиазола, который выделяется в инкубационную среду.Остановку реакции с одновременным отделением продукта реакции от меченного субстрата - тиамина, известное количество которого содержится в инкубационной среде, проводят путем добавления в среду 2 мл этилацетата (соотношение объемов среды и экстр- агента 1:2) и проводят интенсивное перемешивание содержимого емкости встряхиванием, При этом происходит селективное экстрагирование продукта реакции - тиаэола в этилацетатную фазу, а тиамин остается в водной фазе, Для разделения Фаз проводят центрифугирование среды при 3000 об/мин в течение 5 мин,После разделения 0,5 мл этилацетата, содержащего тиазол, вносят вЗаказ 937/43 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-издательский комбинат патент", г,Ужгород, ул. Гагарина, 101 3 146диоксановый сцинтиллятор (5 мл) дляопределения радиоактивности продуктареакции, Радиометрическое измерениепроводят на жидкостном сцинтилляционном спектрометре. Для определенияобщего тиамина строят калибровочныйграфик зависимости количественногообразования тиазона при известнойконцентрации тиамина.Построение калибровочной кривой.В двойной ряд пробирок, помещенныхв водяную баню, разливают по 0,1 млводного стандартного раствора нерадиоактивного тиамина, Концентрациятиамина в водном растворе в каждойпробирке составляет, мкМ: 0,15; 0,3;0,6; 1,5 3,0; 6,0. В одну пару пробирок (контроль) вместо стандартного раствора тиамина вносят по 0,1 млводы. В каждую пробирку дабавляютпо О,1 мл водного раствора, содержащего 2,4 мкМ фС 1 -тиамина, разведенного так, чтобы общее число импульсов в пробе составляло 100000импульсов за 1 мин. В каждую пробирку приливают по 0,6 мл 0,2 М раствора натрий Фосфатного буфера (рН 6,4)Содержимое пробирок перемешивают,В каждую пробирку вносят одинаковоеколичество тиаминаэы (0,0025 МЕ) вобъеме 0 2 мл. Приготовленные пробыЭОинкубируют в течение 1 мин при 0 С,после чего останавливают реакцию.Разделение Фаз после встряхивания втечение 3 мин достигают центрифугированием при 1500 в течение 10 мин.0,5 мл этилацетата, содержащего продукт реакции - тиазол, отбирают иэвсех проб для подсчета радиоактивности.Строят калибровочный граФик, гдепо оси абсцисс откладывают значениянерадиоактивного тиамина в инкубационной среде в мкМ (О;0,15;0,3),а по оси ординат - значения отноше 57624ний радиоактивности продукта реакции,тиазола (С ) без разведения метки(контроль) к С - значению радиоактивности продукта реакции тиазолапри разведении метки нерадиоактивнымтиамином в инкубационной среде.П р и м е р 2, К 1 мл мочи вносят 50 мг активированного угля, Угольотделяют центрифугированием. Десорб-,цию тиамина с угля проводят 2 млподкисленного метанола, Полученныйэкстракт высушивают под струей воздуха. Осадок растворяют в 0,2 млдистиллированной воды. 0,1 мл раствора используют для анализа. Послепроведения в инкубационной средеферментативной реакции, амплитудувсплеска образования тиазола фиксиРуют счетчиком,1. Зная значения Со .(контроль) и Снаходят отношение С /С. 11 олучаютсоответствующую этому значению точ 2 б ку на калибровочной кривой, Этойточке соответствует искомое значение концентрации общего тиамина ванализируемой пробе на оси абсцисс. З 0 формула изобретения Способ определения концентрацииобщего тиамина, предусматривающийприготовление стандартного образцаи исследуемой пробы, введение в нихспецифического, реагента, инкубирование с образованием каталитическихпродуктов и последующим сопоставлением их концентраций, о т л и ч а ю 40щ и й с я тем что с целью увелиУ эчения точности и чувствительности,в качестве стандартного образца используют тиамин, меченный по Си .специфический реагент-тиаминаэу 1,при этом инкубацию осуществляют при0-4 С,