Аналог энкефалина, модулирующий функции мозга, ослабляющий судорожную реакцию, ускоряющий консолидацию и воспроизведение информации в стрессовых условиях

Аналог энкефалина формулы
Tyr D Orn(Ac) Gly PheOH,
модулирующий функции мозга, ослабляющий судорожную реакцию, ускоряющий консолидацию и воспроизведение информации в стрессовых условиях.

Изобретение относится к аналогам энкефалина нового биологически активного соединения, обладающего способностью модулировать функции мозга, ослаблять судорожную реакцию, ускорять консолидацию и воспроизведение информации в стрессовых условиях, что может быть использовано в медицине.
Цель изобретения поиск в ряду производных пептидов новых малотоксичных и более активных соединений.
Поставленная цель достигается описываемым аналогом энкефалина формулы I Tyr-D-Orn(Ac)-Gly-PheOH, модулирующим функции мозга, ослабляющим судорожную реакцию, ускоряющим консолидацию и воспроизведение информации в стрессовых условиях.
Для синтеза аналога энкефалина 1 используют аминокислоты и их производные фирмы "Реанал" (Венгрия). Все аминокислоты, кроме D-орнитина, имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют в капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контролируют с помощью ТСХ на пластинках Silufol UV 254 (ЧССР). Для хроматографии аналога энкефалина используют стеклянные пластинки с закрепленным слоем силикагеля "Silika Gel 60F-254" фирмы "Merck" (ФРГ) в следующих системах: хлороформ этанол уксусная кислота (АсОН) 85:10:5(A); н-бутанол-пиридин АсОН-Н₂О 15:10:3:6(B); н-бутанол-пиридин АсОН-Н₂О 4: 1:1 (C); хлороформ-метанол АсОН-Н₂О 30:20:4: 6(D), 60:18:2:3(E). Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Perkin Elmor 141M" (ФРГ). Кислотный гидролиз проводят 6н.НСl при 120^оС в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на анализаторе Jeol. Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием.
П р и м е р. N-трет-Бутилоксикарбонилглицилфенилаланин (2).
6,6 г (40 ммоль) L-фенилаланина растворяют в 40 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, добавляют 3,34 г бикарбоната натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 г (40 ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонилглицина, растворенного в 20 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов и оставляют на ночь. После завершения реакции (хроматографический контроль) реакционную массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев), охлаждают до 0^оС и подкисляют 0,5 н. соляной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отделяют, водную фазу экстрагируют повтоpно. Объединенные этилацетатные слои промывают водой, насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Кристаллический осадок, полученный после отгонки растворителя, перекристаллизовывают из этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира. Выход дипептида (2) 11,4 г (88% ); т. пл. 133-135^оС; [ ]_D²⁴ + 15,7^o (c 1, ДМФА); R_f 0,73 (А), 0,80.
N -трет-Бутилоксикарбонил- N -бензилоксикарбонил-D-орнитилглицилфе-нилаланин (4).
10,9 г (33,8 ммоль) дипептида (2) растворяют в 50 мл 70%-ного раствора трифторуксусной кислоты (ТФК) в дихлорметане и выдерживают в течение 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают 10,4 г (91%) трифторацетата дипептида (3); R_f 0,63 (D) 0,40 (В).
5,2 г (15,5 ммоль) трифторацетата (3) растворяют в 50 мл ДМФА, охлаждают до 0^оС и при охлаждении добавляют 5,3 мл (31 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 5 мл ДМФА и 8,2 (15,5 ммоль) пентафторфенилового эфира N -трет-бутилоксикарбонил- N -бензилоксикарбонил-D-орнитина, растворенного в 15 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают в течение нескольких часов и оставляют на ночь, после завершения реакции массу обрабатывают аналогично соединения (2). Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "Merck". Элюирование проводят в системе хлороформ-этанол-этилацетат АсОН-Н₂О 285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме.
Получают 5,9 г (67%) защищенного трипептида (4) в виде масла, R_f 0,65 (А), 0,72 (В); [ _D²² + 3,7^о (с 2,04, ДМФА).
N,O-Ди-трет-бутилоксикарбонилтирозил- N -бензилоксикарбонил-D-орнитилглицилфенилаланин (6).
20,0 г (35 ммоль) трипептида (4) растворяют в 100 мл 50%-ного раствора ТФК в дихлорметане и выдерживают в течение 20 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия. Получают 19,2 г (94%) трифторацетата трипептида (5), R_f 0,62 (D), 0,42 (B).
18,1 г (31 ммоль) трифторацетата трипептида (5) растворяют в 100 мл ДМФА, охлаждают до 0^оС, добавляют при перемешивании 10,6 мл (62 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 10 мл ДМФА и 16,6 г (31 ммоль) пентафторфенилового эфира N,O-ди-Boc-L-тирозина. Реакционную массу перемешивают в течение 1,5-2 ч (хроматографический контроль) и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению (2). Продукт, полученный после отгонки этилацетата, размешивают с эфиром и охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром, сушат в эксикаторе и очищают высокоэффективной жидкостью хроматографией на колонке Zorbax C₈. Элюирование проводят смесью ацетонитрил 0,1 М раствор ацетата аммония, 40:60. После лиофилизации получают 14 г (55%) защищенного тетрапептида (6), т.пл. 126-128^оС; R_f 0,75 (A, Merck), R_f 0,55 (B, Merck); [ ] _D²² + 6,3^о (с 1, ДМФА). N,O-Ди-трет-бутилоксикарбонилтиро-зил-N-ацетил-D-орнитилглицилфенилаланин (8).
К раствору 0,79 г (0,94 ммоль) защищенного тетрапептида (6) в 30 мл метанола, 1,5 мл АсОН и 2,0 мл воды добавляют палладиевую чернь и гидрируют. По окончании реакции (хроматографический контроль) катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и фильтруют, затем переосаждают из спирта эфиром, вновь промывают эфиром и сушат в вакууме. Получают 0,64 г (90%) тетрапептида (7); R_f 0,05 (A, Merck), 0,60 (B, Merck); 0,43 (E, Merck).
Раствор 0,8 г (1 ммоль) тетрапептида (7) в 15 мл ДМФА охлаждают до 0-(-5)^оС и при охлаждении добавляют 0,17 мл N-этилдиизопропиламина и 0,18 г (1 ммоль) n-нитрофенилацетата в 5 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают в течение 2-3 ч и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению (2). Получают 0,62 г (83%) защищенного тетрапептида (8), R_f 0,62 (B, Merck), 0,91 (D, Merck), 0,87 (E, Merck).
Тирозил- N -ацеитл-D-орнитилглицилфенилаланин (1).
0,52 г (0,72 ммоль) тетрапептида (8) растворяют в 10 мл 70%-ного раствора ТФК в хлористом метилене и выдерживают в течение 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок переосаждают из спирта эфиром, отфильтровывают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия. Полученный продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке Zorbax C₈. Элюирование осуществляют смесью ацетонитрил 0,2 М раствор ацетата аммония 8:92. Соответствующие фракции собирают и лиофилизируют. Выход 0,18 г (36%) тетрапептида (1); [ ]_D²² + 67,3^o (c 0,51, 0,2 н.AcOH); R_f 0,52 (B, Merck), 0,16 (C, Merck), 0,48 (D, Merck); аминокислотный состав: Tyr 0,82, Gly 1,00, Phe 0,91, Orn 1,04.
Определена биологическая активность тетрапептида (1). Биологическая активность описываемого аналога энкефалина изучена в процессе выработки у нелинейных белых крыс-самцов массой 170-190 г оборонительного условного рефлекса активного избавления и избегания (УРАИ) в У-образном лабиринте. Использована модифицированная методика. Безусловным раздражителем служило электроболевое подкрепление, условным свет и направление правильного выбора освещенного отсека камеры. Использована схема непрочной однократной выработки УРАИ с проверкой воспроизведения навыка через 48 ч. Подсчитывали число ошибок, число сочетаний условного и безусловного раздражителей, необходимое для достижения критерия обученности, и время его достижения. За критерий обученности принимали последовательный 6 и более кратный правильный выбор животным освещенного отсека лабиринта за 1-2 с. Изучали эмоциональный статус, проводили общее наблюдение за поведением животных. Однократно подкожно до начала выработки УРАИ отдельным группам крыс вводили одно из исследуемых соединений: описываемый аналог энкефалина (0,10 и 0,25 мг/кг) или препараты сравнения сиднокарб (3 мг/кг), мет- или лей-энкефалин (по 0,25 мг/кг каждого). В контроле вводили физиологический раствор (равный объем на единицу массы животных).
Противосудорожное действие изучено на модели коразоловых судорог. Введение коразола (пентилентетразола) в дозе 70 мг/кг внутрибрюшно вызывает характерный тонико-клонический судорожный припадок у животных. Исследования проведены на белых крысах-самцах массой 170-190 г. Описываемый аналог энкефалина (0,1 и 0,25 мг/кг) и соединения сравнения: мет- и лей-энкефалин (в тех же дозах) и транквилизатор седуксен (0,25 и 1,0 мг/кг) вводили подкожно за 30-45 мин до введения коразола. регистрировали в секундах латентный период приступа, длительность судорог, летальность.
Нейротропная активность соединений, в частности влияние на процесс обучения и воспроизведения информации при выработке оборонительного условного рефлекса, представлена в табл.1 и 2. Описываемый аналог энкефалина обладает выраженной нейротропной активностью в оптимальном при подкожном введении диапазоне эффективных доз (0,10-0,25 мг/кг), ускоряет консолидацию навыка и его воспроизведение при повторном обучении, в чем превосходит препараты сравнения сиднокарб, мет- и лей-энкефалин. При первичном обучении (см. табл.1) преимущества описываемого соединения менее выражены. Однако при тестировании у этих же животных процессов консолидации информации и ее воспроизведения в процессе повторной (через 48 ч) выработки оборонительного условного рефлекса в стрессовых условиях электростимуляции установлено существенное преимущество описываемого аналога энкефалина перед всеми соединениями сравнения. Преимущество проявляется по всем пунктам регистрируемого физиологического процесса (см. табл.2).
Предварительное введение описываемого аналога энкефалина в изученном диапазоне оптимальных доз 0,10-0,25 мг/кг существенно ослабляет протекание модельной судорожной реакции, инициированной коразолом, увеличивает латентный период судорог, уменьшает клонико-тоническую локомоторику и увеличивает время до летального исхода (время жизни). По данному фармакологическому действию описываемый аналог энкефалина превосходит известные мет- и лей-энкефалин, а также седуксен (см. табл.3).
Изучение острой токсичности описываемого аналога энкефалина проведено при подкожном его введении белым мышам массой 20 1 г. При максимальной изученной дозе 20 мг/кг признаков острой токсичности не установлено. Таким образом, терапевтический индекс описываемого вещества достаточно высок и превышает 200 для дозы 0,1 мг/кг и 80 для дозы 0,25 мг/кг.
Описываемый аналог энкефалина является новым малотоксичным химическим веществом, нейротропное оптимизирующее влияние которого проявляется в виде ослабления судорожной реакции и продления жизни, ускорения консолидации информации и ее воспроизведения в стрессовых условиях, в чем существенно превосходит известные соединения.
Проведенные испытания показывают, что данный аналог энкефалина в 1,5-2 раза ускоряет обучение, упрочнение и воспроизведение информации (условного рефлекса) в стрессовых условиях, в чем превосходит активность мет- и лей-энкефалина, и психостимулятора сиднокарба, а также ослабляет судорожную реакцию, в чем превосходит действие транквилизатора седуксена. Терапевтический индекс заявляемого аналога энкефалина 200.
Использование: в медицине. Сущность: аналог энкефалина формулы Tyr-DOrn(Ac)-Gly-PheOH, модулирующий функции мозга, ослабляющий судорожную реакцию, ускоряющий консолидацию и воспроизведение информации в стрессовых условиях. Реагент 1. Трифторацетат N трет-бутилоксикарбонил N бензилоксикарбонил-D-орнитилглицилфенилаланина, полученный исходя из L-фенилаланина, который вводят во взаимодействие в водно-щелочной среде в присутствии пентахлорфенилового эфира с трет-бутилоксикарбонилглицилом, образующийся при этом N-трет-бутилоксикарбонилглицилфениланин деблокируют, переводят в форму триацетата и конденсируют с пентафторфениловым эфиром N трет-бутилоксикарбонил N бензилоксикарбонил-D-орнитина. Реагент 2: пентафторфениловый эфир N, O-ди-Boc-L-тирозина. Процесс ведут в ДМФА в присутствии N-этилдиизопропиламина при 0°С и перемешивали. Продукт конденсации деблокируют и вводят во взаимодействие с п-нитрофенилацетатом в присутствии N-этилдиизопропиламина. Целевой продукт получен с выходом 36% ( )D²²+67,3 , R_f в трех системах. 3 табл.