Способ идентификации ингибиторов протеиназ

Номер патента: 1178761

Автор: Конарев

ZIP архив

Текст

(51 ЕТЕПЬСТВУ Н,ового ледова стений Ьеш оСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ САНИЕ ИЗОБРЕ Н АВТОРСКОМУ СВ(71) Всесоюзный ордена ТруКрасного Знамени научно-истельский институт защиты р(54) (57) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ путем фракционирования белка в гелях, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения чувбтвительности и упрощенияспособа, на разделяющий гель послефракционирования накладывают листфильтровальной бумаги, смоченной раствором протеиназы в буфере с р оптимальным для используемой про теиназы, и с активностью протеиназы, соответствующей активности трипсина в концентрации 0,025- 0,05 мг/мл, через 10-30 мин бумагу удаляют, на гель накладывают фотопленку типов "Фото" или "Аэропле ка" и инкубируют до визуального обнаружения на фотопленкеполос не разрушенного желатина, снимают фот пленку с геля, накладывают на нее лист влажной фильтровальной бумаги и идентифицируют ингибиторы по зо. нам неразрушенного желатина в виде темных полос на прозрачном фоне фотопленки или светлых полос на темном. фоне на фильтровальной бумаге.1178761 ВНИИПИ Заказ 5609/22 Тираж 525 Подписное филиал 11 ПП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4 Изобретение относится к биохимии растений и может быть использовано также в области генетики, селекции и защиты растений, биохимии питания и кормления. 5Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа,П р и м е р. Идентификация ингибиторов трипсина среди белков зерна пшеницы.Зерно пшеницы размалывают, навеску муки заливают 4-кратным объемом 2 М мочевины и выдерживают 18 ч при 4 С. Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают. 15Изофокусирование белков проводят ,в пластине полиакриламидного геля 125 Х 250 Х 0,2 мм на приборе типа "Мультифор" фирмы "1.КВ" (Швеция) или другом приборе для изофокусирования. Состав геля: 6 Х акриламида, 0,287 метиленбисакриламида, 1 Х амфолитов типа "Сервилат" ("Бела", ФРГ), мож но также использовать амфолиты других фирм, например "Амфолины" ("1.КВ",25 Швеция), с интервалом рН 2-11. Гель полимеризуют на свету после дегазации, добавив к 10 мл раствора геля 0,5 мл раствора рибофлавина (10 мг/100 мл) и 20 мкл ТЕМЕДа. 30 Экстракт белков зерна наносят на гель каплями объемом 0,5-25 мкл на образец. Поскольку ингибиторы трипсина отличаются у разных сортов и Видов пшениц по компонентному З 5 составу и активности, объем экстракта нужно подбирать в каждом отдельном случае для того, чтобы получить контрастный спектр ингибиторов. В описываемых условиях следует нано сить 6-9 мкл экстракта из муки мягкой пшеницы сорта Безостая 1, твердой пшеницы 20-25 мкл, диплоидной одноэернянки 0,5-1,0 мкл. На одной пластине анализируют одновременно 24 образца (1 см на образец) или 48 образцов (по 0,5 см). На гель накладывают электродные полоски,смоченные 1 М ИаОН (-) и 1 М Н,РО (+). Сверху накладывают крышку с 5 О платиновыми электродами. Изофокусирование ведут 2,5 ч при постоянноймощности тока 10 В. Конечное напряжение 1800 В. Электродные полоски удаляют вместе с тем участком геля, на котором они лежали. На гельнакладывают лист гладкой фильтровальной бумаги, смоченной раствором трипсина (0,03 мг/мл, фирма"Бройа", Чехословакия) в 0,2 Мфосфатном буфере рН 8,0, Оптимальный рН трипсина около 8,0-9,0,Гель накрывают полимерной пленкойдля предотвращения высыхания. Через 15 мин бумагу убирают и нагель накладывают фотопленку типа"Фото", предварительно смочивгель фосфатным буфером. Сверхунакладывают жесткую полимернуюпленку для предотвращения подсыхания и деформации краев фотопленки и выдерживают в термостате 35 мин при 37 С. Под действием фермента, адсорбированного поверхностью геля, желатин разрушается,что можно контролировать по появлению мутной жидкости из-под краев фотопленки. Можно также просматривать гель с пленкой на свету, ненаклоняя гель. Момент завершенияинкубации определяется по мере появления различных полос - неразрушенными остаются лишь участки слояжелатина, соответствующие ингибиторам данной протеиназы. Фотопленку снимают с геля, накладывают нанее влажную фильтровальную бумагу,которую затем подсушивают листомсухой фильтровальной бумаги. Фотопленку отделяют от бумаги. Зоны,соответствующие ингибиторам трипсина, обнаруживаются на фотопленке в виде темных полос на прозрачномфоне. Фотопленку подсушивают навоздухе и фотографируют в проходящем свете, Ингибиторы можно такжевыявить на фильтровальной бумаге,которую накладывали на фотопленку после инкубации. Ингибиторам соответствуют светлые полосы на темном фоне,

Смотреть

Заявка

3653896, 11.10.1983

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

КОНАРЕВ АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/38

Метки: идентификации, ингибиторов, протеиназ

Опубликовано: 15.09.1985

Код ссылки

<a href="https://patents.su/2-1178761-sposob-identifikacii-ingibitorov-proteinaz.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ идентификации ингибиторов протеиназ</a>

Похожие патенты