Способ лечения больных с опухолями

(54) СПОСОГ ВЕЧЕРЯ ЕОЛЬ 1 1 ЬтХ СВЯЗЛИ(в 1 ВБ п) 2 ОО 3334 С 1 161) Ь А 61 К ЗАДО А 61 К 3766 терапии злокачественных заболеваний. Целью изобетения является повышение эффективности лечежи Сущность изобретения: вводят Амплиген в кол 71 естве, достигд 1 О 1 дем 50 - 300 мг на 1 Ул крови сразу же после введения лекарства, в сочетании с интерфероном или раздельно. Положительный эффект закл 1 очаетсл в получении ряда положительных результатов при лечении больных с опухот 1 яиц.трольными, в то время как в клетках, обработанных ИФН, уровень этот падает до контрольного, Сохранение увеличения в синтезе протеина в клетках, обработанныхдцРНК, повидимому, отражает значительные изменения в типах Определенных протеинов, получаемых в результате дцРНК-индуцируе. мых измечений в клетках к более дифференцирОвэнному или нормализованнОму КЛЕТОЧНОМУ фЕНОТИПУ,Исследование фосфорилирования протеина В карцинаме мочевого пузыря человека, обработанной ИФН-альфа, показало значительные изменения в фосфорилировании количества прОтеинов по сравнению с необработанными клетками Зозао ет, а 1, 81 оспегл, Валорпу, Аст,а, чо 1, 119, 1984, р. 941). Исследования, проведенные в настоящем изобретении гели полйакриламида не показаны) с ГЬ ПСц-и, 0)д показали изменения, целиком отличающиеся от результатов, полученных для ОбработаннЫх интерфероном клеток. Эти данные, кроме того, более наглядно показывают молекулярные различия между днРНК и лимфокинами исходя из механизма модуляции клеток опухоли, возвраьцения их к более ноомальному фенотипу и фундаментальные различия в путях использования в модуляции иммунодифференциации и иммунной активности.Для специалистов онкологов/иммунологов в практической части изобретения описан ряд способов по выбору Определенных протеиновых характеристик злокачественного процесса для данного типа клетки или характеристик регенерации злокачественных клеток данного типа, а также контрольные изменения для выбранного протеина или Группы протеинов в свете описаний, представленных е нзстоягцем изобретении. Факторы, меняющиеся от человека к человеку, могут предьявлять собственные требования к дцРНК в течение времени, однако это не снижает преимущества изобретения, Надо отметить - наличие необычно высокого уровня нуклеаэы или фосфодиэстеразы может стать поводом для клинициста изменить концентрацию дцРНК в требуемой терапии в противоьюложность той, что указана в примерах и экспериментах,Исследования синтеза протеина дают возможность проследить механизмы, лежа щие в его основе, динамику действия лекарственных средств, определить степень этого действия, устанавливая, например, количество нормалиэованных клеток, пери" од действия лекарственного.препарата и с какоо времени начался положительный эффект, Все э 1 о почти не освещалось в иэвест ных до настоящего времени работах в этой.Области,С. "Собственная" дцРНК, необходимаядля противоопухолевой ИФН-активности в опухблевых клетках Было определено, что противоопухолевая активность ИФН в опухолевых клетках всречается довольно редко и главным образом, когда ИФН-чувствительные клетки имеют предраннюю "собственную" дцРНК,присущуо этим клеткам. Недостающую противоопухолевую активность или достаточное количество собственной дцРНК в клетках можно возместить введением дцРНК для создания условий для необходимого ее присутствия в достаточном количестве.Известно, что интерфероны индуцируют связанный с дцРНК фермент 2,5-олиго- А-синтетазу, который вовлекается в 20 клеточный ингибитор роста. Открытие, сделанное в настоящем изобретении, показывает, что двухнитиевые РНК "работают" главным образом как кофакторы для.активации фермента, что явно отличается.от того утверждения, что интерфероны индуцируют этот фермент, Эти действия ошибочно совмещают, значительно уменьшая потенциальные возможности для успеха в лечении при помощи каждого агента отдельно или в их сочетании. Было показано, что дцРНК в естественном виде встречается в периферических кровлях мононуклеарных клетках (ПУМК) некоторых индивидуумов с лейкозным ретикулоэндотелиозом, хотя они не были найдены в ПКМК нормальных индивидуумов. Действител ьно, и рисутствие дцРНК в "волосатых" клетках(Не а) пациентов с лейкозом, видимо, объясняет в первом приближении известную эффективность иниспользуется отдельно и обеспечивает решающую добавочную дихотомию между ИФН и дцРНК, которая может быть использована терапевтически. Клиническая эффективность интерферона обусловлена индуцировэнием фермента 2,5 оли Го-А-синтетаза) в присутствии предранней внутриклеточной натуральной дцРНК, в то время как экзогенная дцРНК "работает" в значител ьной степени посредством активации ферментов,осуществляя таким образом контроль клеточного роста. Для подтверждения этой новой гипотезы ядерная РН К была выделена из контрольных и обработанных г ИФН-аА "волосатых" клеток(Не а), фракционированных на градиенты сахарозы и тестированных на способность активировать очищенную высокомолекуляр 40 терферона в тех случаях, когда интерферонную 2,5 А синтетазу, Ни одна из Фракцийнеобработанных Неа-клеток РНК не моглаактивировать синтетаэу. Однако гетерогенная ядерная РНК-фракция обработанныхИФН клеток активировала синтетазу зависящим от дозы образом, Горячая денатурация гяРНК устраняла эту активацию. Анализферментного продукта, сделанный при помощи жидкостной хроматографии высокогодавления (ЖХВД), показал, что были получе-. 10ны биологически активные 2,5 -А тримерыи тетрамеры. Была также фракционированамононуклеарно-клеточная ядерная РНК из"волосатых" клеток оольных лейкемией, которые были весьма чувствительны к ИФНтерапии и обнаруживали высокийуровень 2,5 А-синтетазы, активирующей дцРНК вгя РН К-фракции. ЖХВД-анализ показал образование биологически активных 2,5 Атримера, тетрамера, пентамера и гексамера 20(их отношение 53:15:4,1 соответственно),Нормальная мононуклеарно-клеточная ядерная РНКне показала никакойактивности. Зтирезультаты показывают, что натуральнаяядерная РНК существуетлишь в релевантных 25клетках, неопластических или, иначе говоря,когда может участвовать в регулированиироста посредством ИФН. До настоящеговремени существует скрытая и настоятель-.ная потребность в "интерферонном ответе". 30Это позволило сделать вывод, что недостаток дцРНК.может привести к неэффективности инте рферона, которую можнокомпенсировать экзогенной дцРНК, Зто утверждение вполне можно проверить и подтвердить в клинических условиях,Для большей убедительности, можно .еще раз отметить, что для ИФН-активностинеобходимо присутствие редкой дцРНК -"обитателя" в клетках, требующих противоопухолевой активности. Здесь, по-видимому,для опухолевых клеток требуется восприимчивость/чувствительность к ИФН-терапии.Некоторые авторы ошибочно группируютИФН и дцРНК вместе. Из настоящих исследований очевидно, что дцРНК является кофактором, который активирует фермент2,5-олиго А синтетазу. Опухолевые клетки, Нечувствительные к ИФ Н, 6 ри добавлении экэо.генной дцРНК становятся восприимчивыми к 56дцРНК-терапии. В клетках, реагирующих надействие ИФН, дцРНК, очевидно, имееттрехмерную структуру подобно "несовместимой дцРНК, а именно еп г(С 11-14, О)п,.на основе их биологического и каталитического сходства, отсутствия токсическихсвойств, усиленные иммунные функции,сравнимые с цитотоксицескими функциями,а также другие характеристики типа сАМР и параметры их противоопухолевого дейст.вия,Клетки, невосприимчивые к лимфоки. нам главным образом и к интерферонам вчастности восстанавливаютсвою восприимчивость сначала при добавлении эффективного количества экзогенной дцРНК для,индуцирования синтеза необходимой внутриклеточной дцРНК, которая участвует в регулировании клеточного роста в соцетании синтерфероном, а затем при добавлении теперь уже терапевтически действующегоИФН, как уже содержащего необходимуюдобавку дцРНК.Д. Реактивность человеческого ксенотрансплантанта опухоли почки.Восприимчивость человеческого ксенотрансплантанта почки к ИФН и дцРНКабсолютно иная, как показывают описанные ниже исследования на основании наблюдений эа оставшимися долгое время вживых животными.Использование человеческого опухоле-.вого ксенотрэнсплантанта у атимичных мышей дало неожиданные и разные реакциина интерферон и дцРНК. Например, человеческая карцинома почки показывала прогрессирующий .рост опухоли и неувеличивала время выживаемости в течениеинтерферон-альфа-обработки, в то времякак при дцРНК-обработке она демонстрировала значительное уменьшение в размерахи чрезвычайно увеличивался срок выживания организма. Действительно. после смерти в 2-4-летнем возрасте от естественныхпричин 95 всех дцРНК-обработанных мышей не обнаруживали в гистологии, проведенной после вскрытияналичия опухоли.Это было весьма неожиданно, так как лимфокины (например, ИФН) вызывают оченькороткую ремиссию рака и имеется всеголишь несколько, если вообще есть. экземпляров животных, у которых не находили опухоли даже по прашествии несколькихмесяцев. Получение 95 выздоровевших погистологическим критериям и времени выживания явилось весьма неожиданным,Кроме того,.активность селезеноцных клеток "натуральных убийц" (НУ) увеличиваласьпри дцРНК-обработке животных, в то времякак при обработке мышей ИФН НУ-активность не:увеличивалась.Подобное различие в ингибироваиироста опухоли наблюдалось между интерферон-гамма и дцРНК в двух других моделяхксенотранспдантанта, ощутимая разницанаблюдалась также при опытах с челове еской карциномой РТ 4 моцевого пузря ичеловеческой опухолью головного мое а -5 10 20 25 30 35 глиомой А 1235, как было описано, Во всех случаях статистически значительное ингибирование опухолевого раста наблюдалось у животных, обработанных дцРНК, и минимальное - при обработке интерферон-гамма, использованным 8 чистом виде, Значительная разница нэолюдаласьтакже В активности селезеночных НУ-клеток с увеличением НУ-активности при обработке дцРНК и отсутствием увеличения при обработке интерферон-гамма.Подобный эффект наблодался в связи с возрастанием иммуноактивности, результаты опытов с глиомой представлены в табл, 6. Дозировка: 20000 ед. ИФН/интерферон ежедн. Т,р. ГЬг(С 11-ц, 0)п по 2 или 3 раза В неделю (200-500,и г на дозу). Тщательное исследование проб крови, полученных последовательно на протяжении всего времени испытаний из вены хвоста, показало, что днРНК, химический класс которой описан в другом месте настоящего изобретения, может быть введена на неопределенное время, не оказывая при этом какого-нибудь неблагоприятного действия на функции пачек, головного мозга и иммунофункции, т,е, на функции органов, наиболее подверженных токсическим агентам,В табл, 6, которая приводится ниже, представлены данные по иммуноактивности клеток селезенки мышей, обработанных ИФН-Гамма и Или дцРНК. В табл, 6 указаны отношения компонентов исследованной смеси клетос клеток эффектарав(иммунные клетки, полученные хирургическим путем из селезенки животных, которым введен человеческий опухалевый ксенотрансплантайт) и клеток-мишеней (в этом случае опухоль головного мозга человека), Клетки эффекторы являотся иммунными клетками иммунасистемы, а клетки-мишани - клетками исследуемых опухолей, Результаты пред" ставлены в аиде процента цитотоксичности в результате обработки ИФН, дцРНК или обоими агентами вместе, Более высокий процент токсичности показывает увеличение ликвидированных опухолевых клеток,Любопытно, что в этом эксперименте "убитых" клеток после обработки ИФН-гамма даже меньше, чем контрольных(неабработа н н ых), а зффе кт и осле обработки отдельно взятой дцРНК Ьольше, чем при обработке комбинаций дцРНК+ ИФН-Гамма.Эффективность дцРНК, особенно Г 1 л г(С 11-14, О)п, против человеческой опухоли ГоловнаГО мозГа, привитой атимичным мышам, сравнивается с эффективностью ИФН- гамма. Опухоли измерялись на 10-й день и по 31-й день. после начала эксгеримента, дцРНК оазалас баее эффективной в ОГ- ношении уменьшения размеров апухали па сравнению с эффективностью ИФ 1.1, которая оказалас чуьНе ар ьшеной,Е, Клинические примеры лимфакин-устойчивых опухолей, которые восприимчивые к днРНК.Была разработана альтернативная методика, отличная от методики для моделей работы с животными, для оценки апухалеВой Восприимчивости или резистентн Ости, в которой представлена возможная клиническая синергия для комбинации ИФН идцРНК-терапии. Одним из таких методик является метод кологенного анализа, разработанного НагпЬОГЬег и Яа 1 гтоп (РГ 1 гпагу В 1 оаззау ОГ Нвгтап Титог Ятгп Се 1 э ЯС 1 епсе 197:461-463, 1977), который может реально предсказать восприимчивость или резистентнасть организма галета к ле.арственным противоопухолевым средствам с высокой точностью 90 - 950 надежности для неактивных средств и 75-80;4 для активных.В соответствии с методикой, разработанной 1-агпЬОГ 9 ег и Яаглоп, колагенный анализ проводится следующим Образам, Из свежих опухалевых клеток или клеток, взятых от больных лейкемией, приготавливается монаклеточная смесь. Заранее определенная концентрация выбранного терапевтического агента, прасчитанная из литературных источников или методических рекомендаций, вносится в чашку с агаравай или метилцалгнолазнай средой или в клетки после посева. Клетки, ачищенные и высеянные в агаравую или метилцелгюлазну о среду, инкубируются в чашке Петри при 37 С,чта позволяет получить кОлОнию клеточных культур, В соответствии с апределенньм заранее периодом клеточного роста колонии клеток наблюдаются визуально при помощи микроскопа и числа их в каждой чашке Петри просчитывается. Биологически и клетачные смеси колоний изучались весьма тщательно, включая марфалагиа клетки:эриалагию, иммуалагиа и поведение клеток в атимичных мышах, Клетки исследовалисьпри помощи манакланальных ангител проб нуклеинавыми кислотами. Калагенный анализ представляет собой надежное приближение к анализу опухалевых клеток на химическую чувствительность 1 п,1 гга,Калагенный анализ на нескольких апухолевых образцах мажет быть праведен в лаборатории, В пративапалажнасгь ожидаемому недостатку противоопухолевой активнастл, отмеченной в различных рабатах10 15 40 50 по раковым исследованиям (Сопзратоп оГРевазе О. Везитз вЙ зпое Ап 1 пеораз 1 сАоепв. О.Я. Оераапеп о 1 Неай апб НцпапЯегчсез, РиЬс НеаИЬ Яегчсе, Матопапзймез оГ Неай, чоШае 4, 1985), которыеописывают около 100 образцов животных, полученных полиполи С-обработкой и оказавшихся абсолютно нечувствительными или. частично чувствительными к используемомуагенту, в настоящем исследовании наблюдалось 42 6 из предсказанных реакций наобработку "несовместимой" дцРНК в широком спектре разновидностей твердых человеческих опухолей, оторые известны своейнечувствительностью к полинуклеотиднойтерапии,По предварительным клиническимоценкам опухоли. рассматриваемые как чувствительные показатели, дают более 60уменьшения в числе опухолевых клонов.Большое количество подобных тестовкак в лабораториях, так и в клиниках былопроведено на индивидуумах для определения их опухолевой чувствительности к различным генетически классам ИФН и/илиразличным типам интерлейкинов. В частности, пациенты, участвующие в дцРНК-экспериментах, до этого были подвергнутыбезуспешному клиническому лечению мнтерфероном или интерлейкинами дозами,обосновано взятыми из опубликованныхмедицинских данных. Во всех этих примерах применение определенных лимфокиновоказалось безуспешным для предупреждения роста опухоли, в большинстве примеровиммунные клетки оставались неизменными,во многих примерах наблюдалось фактическое уменьшение опухоли в размерах посравнению с ее размерами до обработкилимфокинами в чистом виде,Лабораторно-клинические исследования настоящего изобретения установили покрайней мере три неожиданных результата:Выбранная "несовместимая" дцРНК эффективна, когда неэффективен полиполи С,Выбранная "несовместимая" дцРНКзффективна, когда неэффективен ИФН, используемый отдельно,Синергизм имеет гесто, когда выбранная "несовместимая" дцРНК и лимфокин используются в сочетании,В табл, 7 преДставлены относительныезначения восприимчивости различных гистологических типов человеческих опухолейк "несовместимой" дцРНК. Экспериментыпоказывают более. чем 40 Я, восприимчивости к "несовместимой" дцРН К, т.е. дцРНК соспецифической молекулярной структурой,различного класса опухолей, особеннотвердых опухолей, при этом устойчивые к "чистым" лимфокинам опухоли являются в то ке время восприимчивыми к "несовместимой" дцРНК.Эти результаты являются неожиданными по двум причинам: известной биоинертности дцРНК вообще и клинического отсутствия пользы в лимфокинах,Были изучены результаты воздействия ИФН-альфа, ИФН-бета и "несовместимой" днРНК в кологвнном анализе для меланомы. Процентное содержание контрольных клеток выведено по отношению к дозе гл (611-ц, 0)л вмикрограммахна мл и в ед. ИФН/мл для интерферонов.Рассмотрено также синергистическое антипролиферативное действие ИФН-альфа и гя (С 12. 0)л в человеческой карциноме почки в тех же единицах. В комбинации 20 были использованы для количества г 4 ф/12 0)п 50 и 100 ргlмл. Концентрация ИФН-альфа колеблется в пределах от 0 до 3000 ед. ИФНмл, которая значительно выше нормальной ИФН-альфа терапевтической концентрации.В начале отсчета имеется разрыв линий, обозначающий отсутствие действия на контр. колонии для О ИФН, около 62 О для 50 и 50 для 100 гя (С 12, О)п и затем для 100 ед, ИФНмл ИФН-альфа.Как показывают эти данные, ИФН-альфа в чистом виде не.эффективен в клинически приемлемых дозах, его эффективность наблюдается при более высокой дозировке на цитотаксичном уровне, уровне слишком высоком для клинического использования. Результаты этого исследования показали, что для эффективности терапия количество ИОН должно быть уменьшено до клинически приемлемого уровня и, вероятно, дополнено или заменено другими антипролиферативными агентами.Определенные примеры синергистического действия наблюдались 63мелано 45 ма,50 рака груди,80 О рака яичника и 65 оь рака почкидля комбинированной ИФН-альфа + гЬ г(С 12. О)п-терапии, Таким образом, из этих результатов можно заключить, что а) применение определенной "несовместимой" дцРНК в лимфокин-устойчивых состояниях будет иметь пользу в клинической терапии, в) в случае резистентности организма к.дцРНК в чистом виде приемлемая комбинация слимфокинами оказала бы благоприятное терапевтическое действие в большинстве случаев. Г. Три клинических преьмера, под 1 верждающих эффективность настоя щего изоб ретенияПациент 1- злокачественная меланома.Пациент 1 - мужчина средних лет, имеющий злокачественную меланому, клинически невосприимчивую к ИФН и 1 2-терапии. Введение днРНК(300 мгдважды в неделю) в результате привело к полному рассасыванию опухоли (рассчитывалось количество массы опухоли) за период 86-дневной терапии. Этот благоприятный эффект сохраняется приблизительно 2,5 года ет начала лечения. В настоящее время поддерживается доза между 50 и 100 мг 2 раза е неделю. Дозировка определялась при учете клинической восприимчивости в свете лабщмторных параметров, включающих относительный уровень 2,5 А-синтетаэы и способность обнаруживать активные биохимические посредники в дцРН К-индуцируемом эффекте таких как циклические АМР-уровнй, описанные выше, или существование определенных классов 2,5 -А молекул, в также . усиление иммуноклеточной активности, Наблюдалось почти одновременное увеличение 2,5 -А синтетазы, САРУ и биоактивных 2,5 -А олигомеров, в то время как ни один из них не был обнаружен при лимфацит-терапии или в период неэффективного лечения, Различные олигомеры измерялись в интервале 25 дней до терапии и 1, 23 и 55 дней после начала днРНК-терапии. Низкий молекулярный вес олигомеров 2,5 -А (димеры), определенный в лаборатории заявителя и в другом месте, делает его особенно биоинертным в отношении антипролифера" тивных, противовирусных и иммуноусили" вающих свойств,Подобный биохимический феномен обьяс.няется длительным увеличением активируе. мой лимфокинами акти вностй клеток-"убийц" ( АК); в результате чего наступает стабильное состояние болезни и/или значительная регрессия опухоли, которая измерялась повышеннойАК-активностью(какрасщепления Сг) у пациентов при стабильном состоянии болезни (карциноидный рак), после 30-месячной терапии дцРНК и для сравнения у пациентов, не получивших дцРНК-терапию, и нормальных или контрольных пациентов, Эти данные использовались для контроля относительного количества терапевтических агентов, требуемогодляблагоприятного клинического эффекта в течениеной дозы всего лишь 1,5 м ед, ИФ Н и 300 мг дцРНК, вводимой дважды в неделю, Подобно случаю с хронической лейкемией зта лечебная схема вызвала продолжительную ремиссию у большого количества (по процентному содержанию) пациентов, в то время как у пациентов, получивших лечениелишь ИФН-альфа, такого эффекта не наблю- .далось,Пациент 3,20 Пациент 3 - мужчина средних лет с ИФН-резистентной опухолью почки, у которого в самом начале лечения наблюдалось быстрое уменьшение опухоли одновременно с изменением профиля 2,5 -А олигомеров, быстрое нарушение пути метаболизма 30 в сАМР и резкое увеличение иммуноактивности. Эти важные клинические и лабораторные данные сохранялись в течение 36 мес, никаких побочных эффектов данная те 35 рапия не обнаружила Подобное, благоприятное клиническоедействие описанной терапии наблюдалось у большинства лимфокин-устойчивых опухолей, включая наиболее летальный и неактив 40 ный типы рака легких. Приведены зависимости НУ-клеточной активности (в литических единицах) и соответствующие размеры медистианальной опухоли (в мм ), измеренные СТ-сканированием. Результаты были получены в начале и после завершения длившейся около 400 дней терапии "несовместимой" дцРНК, Пациент показал пол ную восприимчивость к терапии, что подтвердилось измерениями размера опухоли. 50(56) Патент ЕР М 0113162, кл, А 61 К 31/70,1984. длительного периода времени. например для поддержания терапии после начала контроля даже при лимфокинной резистентности.5 Пациент 2.Особого внимания заслуживает тотфакт, что опухолевые метастазы в костях могут быть в значительной степени редуци рованы при помощи терапии дцРНК и ИФН, 10 взятых в сочетании друг с другом. Например, пациент 2 с раком почки и обширными костными метастазами показал быструю и продолжительную восприимчивость к указанной терапии после получения им днев29 30 2003334 дцРНК может быть поли 1 поли С, 0 в Таблица 1 котором отношение С к О составляет около Таблица 2 Антитела к интерферонам не ингибируют вызванную дцРНК антипролиферацию в клетках человеческой глиомыы в процентах от контрольной кул за 24 ч. м е ч а н и е, Результаты предстане делалось бл Индукция интерферона в дцРНК-обработанных клетках человеческой глиомы"Табл и Число воспри-: Ч им,езист стологический тип осприимч,2 4 Рак маткиГлиобластома 2 36 Карцинома легкихРак почки Карциноид Карцинома 179 ательной желе 4 5 Рак яичникаРак молочной железыМеланомаРак прямой кищки 1 О 10 2 Саркома Рак пищевода Эндотиэлома Рак поджелудочной железыРак желудкаМедуллообластома 0 0 85 го целью повыаения эффективности лечения, в качестве рибонуклеиновой кислоты используют Амплиген в количестве, достига- ащем Имг на 1 мл крови сразу же после введения лекарства или после его введения в сочетании с интерфероном, МельниковаталКорректор Е. Папп енияНИХ С ОПУ- мунных на- бонуклеинотем, что, с Подписноеспатентаушскаа наб 4 Л Тираж НПО "Поиск 113035, Москва, Ж, аз 32 Производствен но-издательский комбинат "Патент", г, Ужгоро ул,Гагарина, 101 Формула изобрет СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬ ХОЛЯМИ путем коррекции им рушений двухцепочечной ри вой кислотой, отличающийсяИзобретение относится к использованию двухнитевой рибонуклеиновой кислоты (РНК) отдельно или в комбинации с лимфоклинами для подавления пролиферации опухолевых клеток в теле животных и человека, , коррекции нарушений в опухолевых и раковых клетках в теле животных и человека. и воздействия на нарушения иммунной системы, возникающие из-за предрасположенности некоторых организмов к опухолевым или раковым заболеваниям независимо от того, возникают ли они под действием генетических факторов или факторов окружающей среды. Изобретение относится к использованию РНК в комбинации с другими химическими и биологическими агентами для подавления воздействия этих факторов,1. Интерфероны (ИФН) составляют;.класс протеинов, способных ингибировать репликэцию вирусов в животных клетках.Они имеют клеточную природу, могут быть продуцированы 1 п ч 1 тго или 1 и ч 1 чо и стимулируются большим количеством веществ (ТЬе Епсус 1 ореб 1 э о В 1 осЬеа 1 зтгу, еб. Ьу Иодег чч 1 Нааз апб Едчч 1 п эпзогб, Ие Мо 1 б РоЬ 11 зйпд Соарапу, 1967). ИНФ известен своим как противоопухолевым, так и противовирусным действием (Батоге 262, 300, 1978). способностью восстанавливать контактное торможение и подавление роста в полужидком агаре опухолевых клеток.Двухнитиевый РНК являются индукторами различных молекулярных форм человеческого ИНФ трех типов: альфа (лейкоцит), бета (фибробласт) и гамма (иммунныы), которь 1 ы может быть стимулирован обеими натуральной и синтетической двухнитиевыми РНК, Использование синтетической двухнитиевой РНК для образования комплексов полирибоинозиновой и полирибоцизидиловоы кислот (дальше они обозначены как ги гСп или иолиС) как индукторэ интерферона известно, например, из патента США М 3666646, выданного 1.атрзопет а 1, Кроме своей роли как ИФН-индуктора, двухнитиевая РНК является активатором двух ИФ.Н-индуцируемых ферментов: протеинкинаэы и 2-5-олигоаденилатсинтетазы (Ргос. ИэО, Асэб, Зс 1 75, 5893, 1978), Молекулярные основания для антипролиферативного и противоопухолевого действия интерферонэ и их связи с двухнитиевоы РНК до настоящего изобретения не были известны, кэк и антипролиферативные свойства двух нитиевой РНК, следующие из.ее роли как ИФН-индукторэ.2, Синтетические "несовместимые" аналоги двухнитиевоы РНК,Совсем недавно было обнаружено, чтоИФН может быть индуцирован также несовместимыми аналогами г 1 п гСп, как описанов патентахйв 4130641 и В 4024222, ".ыдан- .5 ными Т эО и Саг 1 ег, Эти аналоги образованымодифицированными г 1 п гСп для включениянепарных оснований (урацила или гуанина)вдоль полирибоцитидилвтноы (гСп) цепи илимодифицированным позвоночным рибози 10 лом полирибоинозиновой кислоты (г 1 п). Несовместимые аналоги, особенно те, чтомодифицированы в гСп-цепи, сохраняютспособность индуцировать ИФН так долго,насколько это отвечает структурным требо 15 ваниям.Длинные участки спаренных основанийдвухнитиевой РНК не являются необходимыми для индуцирования интерферона. Действительно, необходимым условием. для20 синтеза быстро действующих интерфероновявляется сохранение 1/2 - 1-спиральноговитка сггаренных оснований двухнитиевоы .РНК(днРНК),Увеличение скорости гидролиза отмеча 25 лось,. когда несовместимые полимеры подвергались действию нуклеазы (З.Моеа. В 1 о 1.70,567, 1972), однако эти двухнитиевые РНКбыли почти также активны, как и немодифицированные г 1 п гСп, исходя из индукции30 интерферона. Предполагалось, чтодлительное сохранение интактноы двойной спиральной структуры. может быть ответной длямногих других биологических реакций наРКН, обычно отмечаемых как лекарственйая35 токсичность. Исследования "несовместимых" аналогов: г 1 п г(С 11-и)п Аарцепзарегистрированного товарного знака о 1НЕМ ИезеагсЬ, 1 псйосйч 11 е, 10852, СШЪ,в различных животных системах показали,40 что г 1 п г (С 11, О)п менее токсичен, чем г 1 п -гСп (см, ПолиС с "несовместимыми" основаниями, исследования по терапии рака иэо 9 аептп 9 а 9 ептз 1 п Салаг ТЬегару ео теоЕ,М.Н г е а 1, Ра е Р е, Нью-Йорк, 177,45 1981). В частности, повторное введение мышам ги С 12, О)п показало еще меньшуютоксичность по отношению к таким чувствительным органам, как костный мозг позвоночника. клетки печени, тимоциты,спленоциты (З,Мо 1 ес. Во 1., 70, 567, 1972), поскольку эффективность защиты против заражения разновидностью летального вирусасохранялась (Мо 1 ес. РЬэга, 12, 299, 1976).Кроме того, гп С 1-, О) показывает55. уменьшение (100-кратное уменьшение) пирогенеза по отношению к г 1 п гСп укроликов, снижение митогенеэа (5-19-кратноеуменьшение) мышиными и человеческимиклетками и чтго и уменьшение образованиядцРНК-антител (5 - 10-кратное уменьшение) у кроликов и мышей. На фоне этого снижения клеточной токсичности гиг(С 11-14, 0)п сохраняет свою способность индуцировать интерферон, стимулируя функции клеток "натуральных убийц" НУ) (3.авипооду, 124 1852, 1980) и активируя указанные внутри- клеточные медиаторы 2 - 5 -олигоаденилатсинтетазу и специфическую протеинкиназу. Поэтому очевидно, что в различных контрольных системах (кролик, мышь и человек) и при различных схемах дозирования измерения токсических и терапевтических эффектов показывают, что "несовместимый" аналог г г(С 11-14,0),(Агпрреп) имеет усилейный терапевтический индекс. Приготовление и получение этого индуктора/активатора описаны в З.Моес. Во., 70, 567, 1972),Использование модифицированных гЬп гС-аналогов с единственной целью индукции интерферона в животных клетках для противовирусного действия описано в патентах США М 4130641 и Ь 4024222. Од. нако что касается их использования как противоопухолевого агента, то недостаток ИФН-терапии (как и, других лимфокинов, вводимых в чистом виде) заключается в том, что она имеет лишь маргинальный эффект во многих организмах. В результате относительно большое количество лимфокинов, необходимое для введения в организм, приводит к неестественно высокому уровню накопления лимфокинов в нем, которое не могло бы быть генерировано самим организмом в процессе нормальной ответной реакции человека на вирусную инфекцию, иммунной клеточной дифференциации или естественного механизма иммунозащиты против раковых, вирусных и других поражений, При таких высоких уровнях лимфокинов организм реагирует на них как на чужеродные тела и обладает способностью генерировать против различных лимфокинов типа ИФН-антитела, Образующиеся в результате этоо антитела уничтожают остаточн ы й тера певтический полезный эффект. Кроме того, неопластичные клетки, в частности, способны вырабатывать устойчивость ктерапевтическим свойствам различных лимфокинов типа ИФН и других членов семейства лимфокинов, Как будет показано в дальнейшем, эта способность неопластических клеточных линий вырабатывать устойчивость к ИФН достигается не случайным фенотипом, поэтому это служит некоторым препятствием терапевтическим методам, предназначенным для ингибирования полиферации. основанного на использованиилимфокинов в чистом аиде,Настоящее изобретение устраняет недостатки при использовании укаэанных те 5 рапевтических средств благодаря открытиюновых антипрофилиративных агентов и ихсоставов, которые останавливают или значительно замедляют рост раковых клетокнезависимо от того, вырабатывают ли эти10 клетки устойчивость к лимфокинам. Крометого, в предлагаемом способе даны составы,содержащие интерферон, в которых степень содержания его хотя меньше в 20 - 50раз, чем в описанных применениях, тера 15 певтическая эффективность, достигаемаясредствами, описанными в изобретении, неменьше, а даже больше. Так как составы,описанные в предлагаемом способе, содержат .синергетически действующую днРНК,20 то терапевтический эффект от днРНК соответственно болев высокий, чем тот, что былописан в.иэвестных изобретениях, и действительно оказывал терапевтическое воздействие на опухолевые тельца костногоматрикса,опухоль которого известна своейустойчивостью к воздействию экзогенныхлимфокинов, когда они используются в мономодальной терапии.3. Клетки - натуральные убийцы" какиммунозащитный противоопухолевый механизм.Было опубликовано множество статей вподдержку главной роли популяции клеток- "натуральных убийц" (НУ) в иммунозащитном механизме против неопластическихклеток. Мыши с высокой активностью НУклеток более устойчивы к опухолям с НКвосприимчивыми опухолевыми клетками,чем мыши с низкой активностью НУ-клетокпипопо. Реч., 44, 165, 1979), С 57 В 1/6 бежевые мыши, которые были отобраны наНУ-клеточный дефицит, показали более высокую восприимчивость к опухолевому росту, чем изогенные мыши с нормальной45 НУ-клеточной активностью (Каыге ( опб,)284., 622;1980; Налоге, 284, 624, 1980), Подобная ситуация наблюдалась у людей с синдромом Чедиака-Хигаси, предполагалось,что НУ-клеточный дефицит при этом заболе 50 вании может стать причиной дальнейшегоразвития у этих больных лимфомой (, Ехр.Меб, 151, 1039, 1980; 3. Ехр. Меб., 151,049,1980, ча 1 цге( опб), 284. 553, 1980). Больныес хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) отпи 55 чаются более высокой частотой метэстазирования, Ъецег и свагп 1 (и 1, Садсег, 27,321, 1981) оценили НУ-клеточную активность в лейкоцитах, взятых от пац 11 ента схроническим лейкозом после удаления лейкозных клеток, Важно отметить, чо боль 2003334шинство пациентов, страдающих ХЛЛ, имеют минимальную или не поддающуюся обнаружению НУ-клеточную активность несмотря на присутствие лимфоцитов, связанных с НУ-восприимчивыми клеточными обьекта ,ми. Кроме того, реципиенты с почечным аллотрансплантантом, которым назначались. высокодозированные иммунодепрессиенце лекарственные средства, имели в 100 раз больший риск злокачественного развития 10 болезни, у них отмечалась также предельно сниженная или полная потеря НУ-клеточной активности (Тгапэр 1 апцйоп, 29, 214, 1980). Напротив, опосредованные антителами клеточная цитотоксичность(АССС) у этих 15 реципиентов не подавлялась. Из этого сле; дует, что дефицит иммуноклеточной активности является. специфическим, и если он существует, то влечет за собой серьезную 20 сикергический и потенцирующий эффект относительно антипролиферативного воздействия.Например,. использование "рассогласован 40 вательно, они обладают слишком малым риском развития у них антител против 45 предрасположенность к злокачественному развитию/рецидиву болезни;Настоящее изобретение содержит множество открытий, одно из которых заключается в том, что, если даже опухолевые клетки обладают ИФН-устойчивостью, использование специфических лимфокинов в сочетании с "несовместимой" дцРНК дает в результате ной" дцРНК в чистом виде или в сочетании с лимфокинами в организме, которые показывают лишь маргинальную реакцию на мономодальное воздействие лимфокиками, дает в результате усиление антипролиферативного/иммуномодулирующего эффекта дцРНК помимо того, который наблюдается при использовании в терапии дцРНК в чистом аиде. К тому же для многих индивидуумов терапия лимфокинами, например ИФН,представляет собой приемлемый метод лечения, т.е. эти пациенты не нуждаются в излишне высокой дозировке ИФН и, следолимфокинов или появления у них побочных эффектов ка введение лимфокинов, так как эти побочные эффекты непосредственно зависят от дозировки лимфокинов, 8 этом смысле дцРНК усиливает действие лимфокинов и при этом придает методам ИФН-терапии большую эффективность. Поэтому терапевтические методы и составы, рассматриваемые в этом изобретении, улучшают существующие уже методы, основанные лишь ка лимфокинаха также дают возможность применять эти методы к тем пациентам, которые по тем или иным причинам не могут воспользоваться известными,В предпочтительном осуществленииэтого изобретения дцРНК представляет собой "несовместимый" аналог гоп гСп, Как указывалось, этот аналог является результатом разрыва той или иной цепи непарными основаниями, т.е. они не являются парными основаниями Уотсона-Крика, типа урацила и гуанина. Эти "несовместимые" аналоги являются предпочтительным осуществлением предлагаемого изобретения из-за того факта, что они сохраняют антипролиферативные действия немодифицированных г 1 гСл и в то же время обнаруживают значительное снижение тенденций к быстрому возникновению побочных эффектов, таких как повышение температуры, гибель неспецифических клеток, т,е, гибель нормальных клеток организма, и антигенность. Кроме того, обнаружено, что специфический несовместимый аналог ГЬ г(С 11-14, О)п дает сенсационный эффект, даже больше того, который уже описывался, в связи с антипролиферативными способно-стями типичной дцРНК типа гЬ гС. В частности, это позволяет в некоторых случаях исправлять дефекты в опухолевых клетках так, что они перепрограммируются и функционально преобразуются в нормальные.Заявитель Фактически отделял раковые клетки от пациента и неоднократно наблюдал это явление, Помимо этого, обнаружено, что Аврйдеп может эффективно действовать как агент, кррмализующий раковую клетку, в тех ситуациях, когда существуют препятствия для использования лимфокиб нов, Известно, что некоторые химические ибиологические вещества обладают способностью к независимой нормализации раковых клеток, "Несовместимая" дцРНК, а именно гопг(С 11-14; О), расширяет эти возможности в нормализации раковых клеток, в то время как лимфокины часто оказывают противоположное действие, т,е. снижают или уничтожают процесс нормализации.Кроме того, данное изобретение даетвозможность корректировать иммунные нарушения, выражающиеся в предрасположенности к раковым заболеваниям вследствие наследственных факторов или нарушений в иммунной системе, Эти свойства, очевидно, 0 ке относятся к действию ИФН, лимфокина,скорее всего их можко приписать действию "кесовместимой" дцРНК на раковые клетки качественно иным способом, чем это делает лимфокин.б Эти терапевтические составы и методыприменяются для лечения рака, опухолей и неопластических клеток, Лечение в этом контексте является термином, означающим профилактику рака, задержку в развитии5 10 15 20 25 30 35 ао 45 50 55 опухоли (частично или полностью), устранение опухолевых рецидивов, перерождение опухолевых клеток в нормальные, коррекцию связанных с раком иммунных дефектов и обеспечение необходимойзащиты от действия вирусных инфекций, э также различных аутоиммунных реакций на воспалительные СОСтОЯниЯ.Важно отметить, что данное изобретение применяется не только для лечения опухоли рака, после того как они клинически обнаружены, но и превентивно для предотвращения мэлирйзации нэ ранней стадии проявления илФ субклинического течения болезни,. т,е. предраковое состояние может длиться довольно долго, перед тем как появятся видимые признаки болезни, требующей терапевтических методов лечения. Настоящее изобретение предназначено также для предупреждения рака, перед тем как он достигнет клинической стадии, например, в организмах, имеющих высокую степень наследственной предрасположенности к раку. Другими словами, рак можно представить как часть биологического континуума, который может существовать довольно долго, ранние стадии которого можно рассматривать просто как предрасположенность. Изобретение рассчитано не только для лечения клинического рака, но и позволяет использовать его превентивно задолго до появления видимых признаков болезни. Целью изобретения является повышение эффективности лечения.В способе используются терапевтические средства и методы для модуляции опухолевых клеток в сторону их нормализации и потери их злокачественного фенотипа путем введения экзогенной ."несовместимой+ дцРН К в опухолевые клетки. Такими методами, например, являются введение "несовместимой" дцРНК и увеличение внутриклеточного уровня дцРНК. Опухолевые клетки, не реагирующие или мало реатирующие на лимфокины, становятся таким образом реактивными. Введение дцРНК можно осуществлять совместно с лимфокинами. Особенно поразительного эффекта можно достичь в передаче клеткам медленно развивающихся опухолей способности реагировать на антипролиферативное действие на них интерферона.Как было отмечено, многие организмы не обладают удовлетворительной ответной реакцией на канцеротерапию, Основанную на применении ИФН в чистом виде, Следовательно, высокий уровень дозировки, необходимый для результативного эффекта для таких больных, может развить устойчивость организма к производству внутри себя естественного ИФН. Кроме того, тот факт, что резистентность иного вида может быть также развита неопластическими клетками в виде неслучайно приобретенного фенотипа, придает первостепенную важность в понимании значительного угучшения терапевтических методов и средств, полученных в настоящем изобретении, по сравнению с теми методами, которые использовались для подавления у больных опухолевой пролиферации путем применения лишь одного ИФН,Введение ИФН и какой-нибудь дцРНК. т.е. с парными основаниями или "несовместимыми, при осуществлении этого изобретения проводится в "сочетании", в котором оба агента вводятся либо вместе как терапевтическая смесь, либо отдельно, но одновременно, как бы отдельными системами для внутривенного вливания в один Организм. Использование в "сочетании", кроме того, включает введение этих лекарственных средств отдельно, при котором одно из ниэ дается сначала, а второе - вскоре после первого. Все три из этих осуществлений изобретения имеют свои преимущества,Раздельное, но одновременное введение их, например, позволяет Осуществлять независимый контроль над каждым агентом и получить оптимальное средство для каждого пациента.Раздельное введение позволяет для чистого ИФН восстановить маргинальное действие на клетки, которое расширяется использованием дцРНК, Приготовление ИФН и дцРНК как смеси дает быстрый доступ к этому терапевтическому средству при условии, если заранее определить ее оптимальный состав. Ранее были даны комментарии ко всем случаям, рассматриваемым в настоящем изобретении, включай формулу изобретения, где один терапевтический агент вводится в "сочетании" с другим;Аналогично этому терапевтические агенты и их смеси, рассматриваемые в способе, могут вводиться в организм путями, обычно используемыми и известными в медицинской практике, Один из них - внутривенный, но существуют и другие; внутримышечный, подоболочечный, внутричереп ной и внутрибрюшинный.Лимфокины имеют в своем составе: интерфероны альфа, бета, гамма), предпочтительно альфа, интерлейкины, специфические интерлейкины (1, 2 ипи 3) и рекомбинант интерлейкин(И:2), опухолево-некротический фзктор (ТИР), Сюда относятся такжеактивизированные лимфокином клетки "убийцы" (.АК), образующиеся в организме в результате ответной реакции на действие ли фокина,Если интерферон (альфа) используется , как лимфокин, то необходимое количество его составляет от 0,01 до 10000 ед. й на мл жидкости человеческого тела. Если 1.-2, а лучше г 1:2, является лимфокином, то вводимое количестводолжносоставлятьот 10 ед.-2 на кг веса человеческого тела до величины, приближающейся к неприемлемому для пациента уровню токсичности, вплоть до 10 ед. И:2, Однако эти пределы - от 10 з до 10 ед. 1:2 на кг веса тела человека,4Если оба агента дцРНК и лимфокин вводятся в сочетании, как было описано, то они могут быть введены в смеси, отдельно, но одновременно или один за другим. фЕсли лимфокины и дцРНК вводятся в сочетании, то дцРНК может быть введена в количестве, которое приводит к уровню от 1-1000 мг дцРН К на мл жидкости в организме, т.е. раствора сыворотки, солей, витаминов и т,дциркулирующего в организме.Например, введение состава, содержащего 10 мг дцРНК в организм весом 1 б 0 стоун ( 72,4 кг), дает в результате степень содержания РНК около 1 мгlмл. Аналогичным образом количество интерферона при введении дцРНК - ИФН составит уровень в пределах 1-100000 ед, ИФН на мл жидкости в организме, Способ введения этого сочетания, как было описано, может быть выполнен следующим образом: в качестве смеси, отдельно, но одновременно или один за другим. Все дело в том,что введение этих агентов дает синергическое действие, в каком бы практическом воплощении этого сочетания их ни брать.Под "несовместимыми" дцРНК подразумеваются те дцРНК, в которых водородные связи (упаковка оснований) между двойными спиралями относительно интактны, т,е.они прерываются в среднем меньше, чем одна пара оснований в каждом 29 последовательном основном остатке. В соответствии с этим и следует понимать термин "несовместимая" дцРНК, дцРНК может быть комплексом из полиинозината и полицитидилата, составляющих пропорцию оснований урацила и гунадина, например, от(1-5) до(1-30)(полиПоли(С 4 - Сгд к хО или 6). С другой стороны, соответствующие олигонуклеотиды (малые нуклеотидные фрагменты) могут быть соединены с соответствующими комплементарным полинуклеотидами или олигонуклеотидами при некоторых обстоятельствах..вводится до статочно для достижения пикаконцентрации крови от 0,01 р г на мл дцРНКдо 1000 р г на мл дцРНК в системе кровооб 35 ращения вскоре после введения.Как было установлено, в предлагаемомспособе лучше всего использовать дцРНКтИПа Гл ГС(С 11-14, О)л двя ИНГИбИрОВаНйянеопластических клеток, Было отмечено, что40 "несогласованная" дцРНК дает более слабый фармацевтический эффект по сравнению с дцПНК, имеющей парные основания.Была исследована также активность другихтипов ИФН помимо ИФН-фибробласта,45 включая естественные человеческие лейкоциты и ИФН, продуцируемые в бактериях,при помощи ДН К-рекомбинант-технологии(г 1 ЕЙ). Во всех случаях ИФН оказывают более слабое действие на опухолевые клетки50 человека, когда они вливаются в чистом виде, чемкогда они вливаются вместе или последовательно в нормальной или"несогласованной" Р Н К. Максимум умен ьшения человеческой опухоли составлял 33055 по ширине при впрыскивании ИФН концентрации 10 -3 10 ед. ежедневно, Напро 5, бтив, у животных, подвергнутых введениюИФН в сочетании с дцРНК в количестве уже10 ед. ИФН ежедневно, наблюдалось умень 30 дцРНК может быть представлена основной фоРмУлой глКС 11-.14, О)л и, в частности, г 1 (С 12, О)л. Другие приемлемые примеры дцРНК обсуждаются ниже.5. Несовместимые" дцРНК, наиболееподходящие для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных из поли (Сл, О) и поли (Сл, 6), где и - целое число, принимающее 10 значения 4-29, и являются "несовместимыми"аналогами комплекса соединений полирибоцитидилата (гСЛ), например, образованного посредством включения остатков 2-0-метилрибозила, Эти "несовместимые" 15 аналоги г" гСЛ, наиболее предпочтительнымиз которых является гл (С 12, О)л, описаны Сайег и Тзо Ь патентах США М 4130641 и ЬВ 4024222. дцРНК, описанная там в общих чертах, является наиболее походящей для 20 использования в изобретении.Определенные примеры "несогласованных" дцРНК для использования в настоящем изобретении включают;шение опухоли на 65 больше у 11 еньше 11 ия человеческой опухоли, Б соответствии с этим е 1 а РН К, применяемая в сочетании каким-либо Одним видам ИФН, дает в результате качест 8811 на 501188 ВысОкий эффект. Кром 8 ТОГО, человеческие опухоли требуют индивидуальнага ре 1 кимд лечения для получения оптимального терэцевти 1 есхага эффекта, В дальнейшем усилия по индивидуализации схем лечения привадяг к ожидаемому 10-кратнал 1 у увеличени 1 а терапевтического эффекта там, где "несовместимая" дцРНК применяется в сочетании с ИФН. Данные убедительно паказыва 1 ат, что днРНК расширяет терапевтическую эффективность всех фарм ИФН, включая натуральну 1 о, си 11 тетическую и гибридную формы тица полученных частична из альфа, бета и гамма-ИФН. Б соответствии с этим сочетание днРНК. особенно "несогласованной" дцРНК, э именно ГЬГ(С 11-и, 0)л, с ИФН входит в технологию приготовления сильнае 1 сй 1,113 ующеГО лекарства против рака, намного превышающего возможности чистого ИФН. Кроме того, при изучении структуры человеческой опухоли становится очевидным, что содержание в ней различного типа вирусной генетической информации безусловна вносит свой гклад в злокачественные иили патологические процессы в человеческих тканях, являк 1 щихся причиной их нарушения и болезней. Поэтому важно, чта комбинация дцРНК - ИФН является.не только противаопухолевым агентом, наи таким же эффективным средствам против вирусных болезней, Действительно, терапевтические смеси, описаннь 1 е в этом изобретении, будут эффективны против болезней, для которых показано лечение ИФН, включая вирусные. заболевания в острой, подострой, лате 11 тной и хронической стадиях, а также забое 1 свания, связаннь е с нарушением иммунной систелы, но которые могут исчезнуть при васстд 11 овлснии дутаиммуннай защиты,Важна подчеркнуть, чта рое 1 ь ДЦРНК в С 11" нергистическам усилении эффекта лечения при использовании соединения дцРНК - ИФН не 81 ол 1, что аиэ стимулирует ИФН, иначе этот синсргизм не набл 1 адался бы. Скорее всего "несовместимая" дцРНК вносит специфический в лдд, котарыйдополняетдействис ИФН, делая его более пластич 11 ым и эффективным, чего нсльзя было бы добиться, используя при ле 18 н 11 и рдкавых или вирусных заболеваний только ИФН или дцРНК отдельно. Были проведены наблюдения некотары;( пациентов с ракам легких и пациентов с высакаи степенью наследственной предрасцое 10 ке 1 насти к раку, у всех отмечался40 45 ДЦРР 1 К-и 11 дукция Ц 11 клич 8 скОГО дД 8 назинма 11 офасфатд(сАМР) была обнаружена в клетках, известных своей нечувствительностью к альс 1 атерферану. Эти исследования были проведены с Двумя САМ к 11 назаингибиторами,обоздчснными как Р Ри Р 1 А 1004 (известные 118 табали 1 сские инГиаитары прОтсинкинэзы С и сА 1 ВПкиназы), Для ОЦенки надай противоопухолевой мадулируг 01 дей экт 1 глнасти несовместимой ДЦР РК в виде резистентности к Одном адал ьнай лимфакин-терап и и, использующей альфа-интерфсран как прототиц лимфакина, Для демонстрации "несаьмсстимзй" ДЦРНК не 11 равОДилась индуцирования 11 нтерферанэ в ИФН-нечувствитсльных клетках, для эГОГО клетки чела" веческай Глиомы(опухали мозга)(А 1235) былиОбработаны дцРНК за различные промекутки врел 18 ни ат 0 да Б ч, ДцРНК удалялась идабавляе 1 ась свежая среда в течение 24 ч, затем тиГры 11 нтерф 8 р 011 д (8 Д, И Ф Н /мл) низкий уровень активности Иу-клеток. Эти наблюдения описаны ниже. Было проверена, можно ли у пациентов с высоким наследственным фактором риска восстановить НУ-клеточну 10 активность до нормальнога уровня при помощи добавок различных типов ИФН иЬли "несовместимых" дцРНК.Работы, появившиеся в последнее время, показывают расхождение в эффективном увеличении НУ-клеток(клетки были взяты отнормальных организмов) среди натуральных типов (ВГР, 3. Маев., 50, 85, 1902) и кланмрованных падтипов интерферона ;Сап, Вез, 42, 1312, 1982), Было отмечено, что "несовместимая" РНК имеет более ярка выраженную способность к рестабилизации нормального уровня НУ-клеток у пациентов с высокой степенью наследственной пред. расположенности к раку.20 Далев приводятся примеры, поясняющие настоящее изобретение, все доли и процентное содержание в которых берутся ат веса, дцРНК (" несовместимая" ), которая используется в примерах, имеет ФОРМУЛУ Ге 1 Г(С 11-И, Цл, ИНОГДа ИЗВЕСтная как г 1 П (С 12, 1 е).А, дцРНК - новый механизм модуляцииопухолей,Новый механизм модуляции опухолейпосредствам "несовместимой" дцРНК нс является лишь часть 10 основного механизма-Действ 1 я лимфокинов, Настоящее исследавание демонстрирует широкие основаниядля использования при модуляции отклоненных ат нармь 1 клеток человеческой опухоли, причем механизм этой модуляции отличается от механизма, действующего при индуциравании ИФН, 0 частности,2003334 16 щи использования антител к интерферону, который при его наличии в клетке был бы связан с антителом, антипролиферативный днРНК- вызванный эффектуменьшился бы, .5 Использовались три типа антител к интерферонам (альфа, бета, гамма) в 240 нейтрал.ед./мл и контрольные клетки. Анализ на ингибирование опухолевого роста был выполнен в соответствии с описанием НцЬЬеИ ет 10 аЬ. Сапсег Вез, 44:3252-3257 (1984), Процентное содержание контрольной культуры антител было подсчитано следующим образом: ьные клеви Оч контрольные клетки ч - контрольные клег ч глиомы, который может быть непосредст вают противодействие противоопухолевому 25действию дцРНК, как это показано в табл, 3. дцРН К в чистом виде "работает" на уменьше- . 30ние процента контрольных клеток; наличие 35 40 4550 проверялись на цитопатический эффект (Гптег. й,б., . Оеп Иго. 5: 419-427, 1969). Результаты приведены в табл, 1, где нижний предел обнаружения составил 5 ед, ИФН/мл,Из этого следует, что дцРНК не индуци,ровала интерферон в этих нечувствительных к ИФН клетках.Затем подобные клетки были подверг. нуты подкрепляющей проверке для того, чтобы определить, играет ли интерферон роль антипролиферативного действия в указанных клетках, вызванного воздействием на него днРН К. Это было сделано.при помооб аботанные клетки 24 ч - к(ЮРезультаты представлены в табл. 2.Эти.данные также, подтверждают, что дцРНК не индуцировала ИФН в исследуемых клетках.Было найдено, что дцРНК индуцирует циклический АМР в клетках человеческой венно приписан кдцРНК, а не к ИФН-индукции в этих клетках, Три известных метаболических ингибитора: Н, НА 1004 и коклюшный токсин - ингибируют или оказыБыл снова оценен процент клеточных культур для .получения низкого процента контрольных культур, как и в табл. 2. "Несовместимая" ингибитора увеличивает клеточную культуруВ табл. 3 показано противодействие метаболическими ингибиторами Ни НА 1004 протроопухолевому действию "несовместимой" дцРНК в клетках человеческой глиомы. Величины снова даны как процент контрольных клеток для дцРНК в концентрации от 0 (слепая проба или контрольная),25 и 200 мг/мл. Аналогичным образом ниже показано,как предварительная обработка клеток человеческой глиомы коклюшным токсином ингибирует дцРНК-индуцируемую антипролиферацию. В табл, 4 дан процент контрольной культуры за 24 ч в клетках, предварительно обработанных коклюшным токсином в течение 4 ч до добавления дцРНК. Это показывает, что Ни НА 1004 - два известных ингибитора оказывают минимальноедействие на опухалевое ингибирование в клетках, обработанных альфа-интерферанам, в та время как каклюшнйй токсин, имеющий, по-видимому, двухфазовое действие, не изменяет ингибирования опухолевых клеток альфа-интерфе- . роном при больших дозах и усиливает антипролиферационное действие в малых дозах. ИФН-альфа не увеличивает внутриклеточный сАМР-уровень в такйх же клетках на протяжении 24 ч, как показано в табл. 5. В этой методике клетки человеческой глиомы А 1235) подвергались действию интерферан.-альфа в количестве 0(контр.), 250 и 1000 ед. ИФН/мл в течение 24 ч от начала эксперимента.В этой таблице даны величины пмЬль сАМР/мг протеина; предел точности определения - 0,02 пмоль сАМР/мг протеина.Внутриклеточный уровень сАМР определялся затем косвенным методом путем измерейия каталитической активности аденилата (пмоль сАМР, образованного за 15. мин) в клетках человеческой глиамы сразу после обработки их антипралиферативнай дозой дцРНК (25 и 200 г/мл) в течение 30 мин и 24 ч. В этой процедуре клетки обрабатывались "несовместимой" дцРНК, 25 (сплошной треугольник) или 200 (сплашнай квадрат),и г/мл "несовместимой" дцРНК, В соответствующей точке времени обработки (0,5-30 мин и 0,5-25 ч) среда была удалена, а клетки быстро заморожены сухим льдом. Активность ауенилатциклазы в гамагенатах, полученных из клеток при воздействии ультразвука. была исследована методом ,оппд, .ет а Моес. Еп 1 асгпа. 1:884-888, 1987. Клетки были сосчитаны в течение 24 ч для проверки антипралиферативнай активности, Индукция сАМР в дцРНК-обработанных клетках человеческой глиамы (А 1235) измерялась непосредственно как.пикамальсАМР на микрограмме протеина, результаты более 30 мин и более 24 ч. В этом методеА 1235-клетки обрабатывались 25 (треугольники) или 200 (сплошные квадраты) р г/мл"несовместимой" дцРН К, В соответствующих временных точках среда удалялась ивнутриклеточный сАМР отверждался в 0,1НС 1, Уровни сАМР определялись при помощи РИА-мЕтсда, как ОпиСанО ВЕЗПЕ Ет а,Се. Во. 102: 1630-1637, 1986. Уровни 10сАМР в контрольных клетках и клетках, обработанных 1 р г/мл днРНК, были ниже.границы точности обнаружения, Клеткисчитались 24 ч для проверки антипролиферативной активности. 15Было замечено ярко выраженное увеличение сАМР после всего лищь 30 с действиядцРНК, этот уровень сохранялся в течение30 мин,Исследования подтверждают увеличение сАМР-уровня, что непосредственно связано с действием дцРНК, так что дцРНК неявлялась ИФН-индуктором в используемыхклетках, Антипролиферативные дозыднРНК индуцировали.активность аденилатциклазы через 30 с после начала испытания,Аналогичным образом, внутриклеточныйуровень сАМР .увеличивался в зависимостиот антипролиферативной дозы через 30 сПредварительная обработка клеток коклюшным токсином, а также ингибитора внутриклеточного сАМР с последующей обработкойдцРНК подавляет дцРНК-индуцированныйопухолевый ингибитор, Напротив, антипролиферативные дозы натурального человеческого ИФН-альфа не увеличиваютвнутри клеточных сАМ Р-уровней за 24 ч экспе-.римента. Кроме того, два известных ингибитора Ни НА 1004 оказывают минимальноевоздействие на опухолевое ингибирование в 40клетках, обработанных ИФН-альфа, в то время как коклюшный токсин обладает, по-видимому, двухфазным действием, как былоуказано выше.45Исследуя сАМР-системы с ИФН-индуцированной пролиферацией (Раппегз ет а,,3. Се Яс., 48:259, 1981, Вапегее ет а,Игооцу 129:230, 1983, ЕЬзаопЬ ет а,., СеРоузо, 120:146, 1984), обнаружено, что 50сАМР не связан со степенью антипролиферующего состояния, Что касается дцРНК вэтих же системах, то эти исследования ранее не проводились, Исследования, проведенные в настоящем изобретении, 55подтверждают заключение, что а) днРНК илимфокины, прототийом которых являетсяИФН, имеют разные механизмы действия ив) дцРНК-индуцированная антипролиферация связана с сАМР-системой (в то время как лимфокины - нет),В этом смысле сАМР является убиквитарной системой по существу, т,е. более или менее все клетки обладают генетической информацией, необходимой для синтеза сАМР при соответствующих стимуляторах. Эти эксперименты показывают широкие воэможности для использования "несогласованной". дцРНК в модуляции отклоненных от нормы клеток, которые частично или полностью резистентны к ИФН или другим лимфокинам, применяемым в чистом виде. Кромй того, эти результаты позволяют предположить, что "несогласованная" днРНК действует при помощи двух последовательных механизмов: первый посредством сАМР-киназы, второй посредством модуляции продеинкинаэы С.В. Синтез протеина.Внутриклеточный протеин изменяет в дцРНК-обработанных клетках рефлективную прогрессирующую дифференциацию и потерю фенотипа злокачественных клеток, противолимфокинных свойств.Нормализация клеток после обработки днРНК в некотором смысле изучалась Возац еф а 1, ВасЬегпса апс Вормузса ВезеагсЬ Соавопсабопз, 119;941-948, 1984, Метод, в котором клетки опухоли головного мозга (А 1235) обрабатывались антипролиферативной дозой "несовместимой" дцРНК (1 00,и м/мл) или натуральным человеческим ИФН-альфа (100 р м/мл), показал значительные различия в характере синтеза протеина в течение периода 72 ч. Синтез протеина является важным параметром, так как показывает нормализацию обработанных атипичных клеток и время продолжительности терапевтического действия, Синтез протеина оценивался путем счета меченных радиоактивным изотопом клеток А 1235 по отношению к заранее установленному числу клеток. Эти клетки не были обработаны, обработаны лишь ИФН-альфа в концентрации 100,и м/мл, дцРНК в конц.200 р м/мл совместно ИФН-альфа с дцРНК. Измерения проводились за 24, 48 и 72 ч.За 24 ч измерений изменения в синтезе протеина по сравнению с контрольным образцом были незначительны, измерения в течение 48 ч показали значительное увеличение синтеза протеина, стимулированного обоимиагентамидцРНКи ИФН, причем при дцРНК-обработке это увеличение значительно выше, чем при ИФН-обработке. Поразительно, что за 72 ч измерения синтез протеина а клетках, обработанных рцРНК, увеличивается е 3 раза по сравнению с кон