Способ получения антибиотического комплекса, включающего непланоцины а, в, с, д и f

ОП ИКАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ЙА 7 ЕНХУ Союа Соввтския Соцналистичеовя Республикпо пеппи изобретений и открытийДата опубликования описания 15.02.82 Иностранцы Масару Отани, Сатоси Ягинума, Масатоси Цудзино, Наоки Муто,Тецу Саито, Тадасиро Фудзии(72) Авторы изобретения Иностранная фирмаДзозо Кабусики Кайсямикробиокасает Изобретени гической пр относит где Х - БН ипи мыиленности интибиотиков.й антибиотическиспособ его получнаучно-техническ олччени-Нрб ил комнияй Предложен алекс новый в патентной О ется пмплексфем, что комплны А, В лунон,О и Г.ОУ гРг-Г- - О - ц ОлснтнОЯ СВЯЗЬ 079реде,азовыде" ураль его на литературе не описан.Целью изобретения явл чение антибиотического к включающего непланоциныЭта цель достигается получение гнтибиотическо са, включающего непланоц О и Г общей формулы осуществляют путем культивирования штамма Аври 11 аге 11 а АИ РЕВИ-Р В 4494 в питательной ссодержащей источники углерода та и неорганическое вещество, лявт целевой продукт из культ ной жидкости и(или) разделяют 20 непланоцины А, В, С, 0 и Е.Итамм, продуцирувщий непланоцнны,выделен из образцов почвы, взятой с поля в Ниагатакен (Япония), которое засеяно луком, относится к роду 2 Ащро 11 аг 1 е 11 а виду Ащрц 11 аг 1 е 11 аполненную Сефадексом 6"15. Элюирование осуществляют водой, и Фракционируют каждые 3 г элюата. СобираютФракции РИ 17-19, концентрируют иохлаждают, получая 35 мг кристаллического производного непланоцинаО (1 Ч),(выход 90%) .Производное непланоцина О(Ч) имеет следующие физико-химические характеристики.1 сО =-141,7,(с=0,7, вода), 1 аМолекулярная форр.ула С НМ 10 5,42.Молекулярный вес 294 (масс-спектр).Точка плавления 177-178 С. УФ спектрв воде 2220 А, Е =41,8, 2880 А,Ею,.=676,3, 2950 А, Е и=676,3, 2950 А, 5Е =670,7, Величина РГ. Пропанол:концентрированный водный раствораммиака; вода=10:1:1, РХ =0,42.П р и м е р 7. Синтез непланоцина А осуществляют из производного 20непланоцина О (1 Ч) . 50 мг производного непланоцина О (1 Ч) р полученного в соответствии с методикой по примеру б, растворенного в 1,5 мл метанольного раствора аммиака (О С насыщение),помещают в запаянную трубкуи выдерживают при 146-148 С в течение 7 ч, После удаления растворителя при пониженном давлении остаток растворяют в 3 мл горячей воды, затем зоохлаждают, получая 33 мг непланоцина А в виде игольчатых кристаллов,(выход 74%),П р и м е р 8. К 1,14 г непланоци 35 на О в 12 мл безводного пиридина добавляют 1 мл уксусного ангидрида и выдерживают при комнатной температуре в течение 8 ч. Добавляют 30 мл н-гексана и охлаждают в ледяной воде, получая 1 г кристаллического соединения ( 2).1 г соединения (2 ) добавляют к 25 мл раствора, 0,8 мл тионилхлорида и 0,4 мл диметилформамида.в хлороформе и кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч при комнатной температуре, Хлороформ отгоняют при пониженном давлении, Остаток вливают в 100 мл ледяной воды при пере 50 мешивании. Осуществляют экстракцию 100 мл хлороформа, промывают бикарбонатом натрия и водой и сушат сульфатом натрия, После сушки в вакууме получают производное непланоцина О (3) .55П р и м е р 9, Синтез иепланоцина А иэ производного непланоцинаО (3),К производному непланоцина О (3),приготовленному в примере 8 и помещенному в стальную закрытую трубку, добавляют 35 мл насыщенного раствора аммиака в метиловом спиртеи проводят реакцию при 100 С в течение 5 ч. После охлаждения реакционную массу сушат в вакууме и получают кристаллический порошок, которыйподвергают хроматографической очистке на силикагеле. Получают 286 мгнепланоцина А.Физико-химические характеристикиидентичны тем, которые отвечают непланоцину А, приготовленному в примере 7,П р и м е р 10. Через колонку, заполненную 20 л катионо-обменной смолой Амберлит 1 Р(Петипа) пропускают Фильтрат (140 л, активностью примерно 50 мкг/мл как (непланоцин В) при-отовленный в соответствии с методикой примера 1, и затем промывают колонку примерно 100 л воды. Элюирование адсорбированного материала осуществляют нормальным водным раствором аммиака, рН 3,7Начальный элюат (30 л) сливают, а последующие 90 л элюата собирают, регулируют рН до 8 добавлением бн. соляной кислоты, затем загружают в колонку с 4 л активированного угля, промывают водой, элюируют 90 л 70%-ного водного метанола. Таким путем полученньн. элюат концентрируют получая 500 мл концентрата, который выдерживают при низкой температуре для осаждения материала, Осадок собирают и сушат, получая 5, л сы - рого непланоцина В (чистотой примерно 60%, выход 44%) .П р и м е р 11. Полученный в примере 10 непланоцин В (5,1 г) вводят в колонку с 2 л силикагеля (8,3 х 40 см), заполненную вместе со смесью ацетона и воды (10;0,5). Последующее элюирование осуществляют той же смесью растворителей, фракционирунт каждые 80 г элюата, и фракции 1111- 16-24 объединяют, Указанные активные Фракции выдерживают при низкой температуре для осаждения непланоцина В в виде белых пластинчатых .кристаллов, Получают 2,57 г кристаллического непланоцина В (выход 32,8%).П р и м е р 2. Культивирование осуществляют в соответствии с22 906388 г 1,2 гокоХ - ИН или ОН 0 Ч. 0- ИЛО 35 о тличаю штамм Аврц 11 аг Р 4494 культив среде, содержада, азота и не ство, выделяют культуральной делявт его на РиЕ. епланоцио признакполучение Приорит25.05,78 а.О.79 плано лучени 50н 23.02 В и Е чение непланоцин ираж 504 Подписно аказ 419/7 тент", г. Ужгород, ул. Проектная,4 илиал ППП методикой примера 1, получая около 200 л культуральной массы. Эту массу фильтруют, и клетки промывают водой. Объединяют фильтрат и промывочные воды, получая 140 л (активность примерно 1,5 мкг/мл).Раствор пропускают через колонку с 20 л катионо-обменной смолы Амберлит 1 К(Н+ типа),для поглощения материала и затем промывают колонку водой (примерно 100 л), Элюирование осуществляют 3,7 н. водным раствором аммиака и сливают начальный элюат (30 л), 90 л последующего элюата собирают, регулируют его рН до 8, для чего добавляют 6 н. соляную кислоту, затем вводят в колонку с 4 л активированного угля, промывают водой, элюируют 90 л 70%-ного водного метанола. Таким путем по лученный элюат концентрируют, получая 500 мл концентрата. Сушкой при температуре ниже 0 С получают 3 сырого непланоцина Е (чистотой ло 0,5%). 2П р и м е р 13. В колонку с 800 мл силикагеля и заполненную смесью - н-бутанол: 28%-ного водный аммиак: вода:0,2;1 вводят 31,2 г сырого порошка непланоцина Е, приготовленного в соответствии с методи" кой примера 12, и элюируют той же смесьв растворителей, Фракционируют каждые 150 мл элюата и объединяют Фракции РР 5-10. Указанные Фракции концентрируют в вакууме, Концентрат вводят в колонку с 240 мп силикагеля, предварительно заполненную смесью растворителей - хлороформ метанол: уксусная кислота=10:2:0,2, и элюируют той же смесьв растворителей. Получают фракции по 20 г. Объединяют фракции РР 67-120, концентрируют их и сушат, в результате получают сырые кристаллы непланоцика Е (108 г, выход 51%) .П р и м е р 14. Полученные в примере 13 сырые кристаллы непланоцина Е (,108 г 3 вводят в колонку с 186 мл Сефадекса 6"15, заполненную водой. Злюирование осуществляют водой. Отделяют Фракции по,10 г и собирают Фракции Р 22-27. Указанные Фракции объединяют, концентрируют до 5 мл и выдерживают на холоде для осаждения непланоцина Е в аиде белых кристаллов, Осадок фильтруют и сушат, получая кристалличес,кий непланоцин Е ,(87 мг, выход 41%).Предложенный способ позволяет получить антибиотический комплекс. включающий непланоцины А, В, С, 0 и Формула изобретенияСпособ получения антибиотического комплекса, включающего непланоцины А, В, С, О и Е общей форму- лы где г- - Оолснтпноя с 3 язь, щ и й с я тем, что 1 е 11 а А 11079 ЕЕВИ- ируют в питательной щей источники углероорганическое вещецелевой продукт из жидкости и (или) разнепланоцины А, В, С,0.08.78 - получение неплано906388 3А 11079 и находится на хранении в постоянной коллекции в институте микробиологической промышленности и технологии в Японии, под номером РЕВИ-Р У 4494.Морфологические признаки.На среде неорганическая соль с крахмальным агаром при 30 С образует искривленный и разветвленный субстратный мицелий диаметром 0,5- 10 0,8 мкм и не совсем созревший воздушный мицелий.форма спорангий цилиндрическая или бутылочная, размер 5-15 10- 25 мкм. 5Спорангиоспоры находятся в параллельных цепях со спорангием. Спо" рангиоспоры имеют полярно расположенные жгутики и имеют форму палочек размером 0,5-1,01,0-2,0 мкм. 20Купьтуральные признаки.Среда Воксмана Р 1. Рост слабый, спорангий не образует, субстратный мицелий бесцветный или бамбуковый, растворимый пигмент отсутствует. 25. Питательный агар, Рост слабый, спорангия нет, субстратный мицелий от светло-янтарного до светло-коричневого, растворимый пигмент золотисто-коричневый. 30Агар Эмерсона. Рост хороший слорангий отсутствует, субстратны мицелий светло-коричневый-камелевый, растворимый пигмент бледно-золотисто-коричневый.35 Агар Беннета. Рост хороший, спорангий отсутствует, субстратный мицелийянтарный, растворимый пигмент бледнозолотисто-коричневый,Дрожжевой агар Чапека. Рост хороший, спорангий мало, субстратный мицелий янтарный, растворимый пигментотсутствует.Казеионовый агар. Рост хороший,спорангий отсутствует, субстратныймицелий от камелевого до светло-коничневого цвета, растворимый пигментгвоздично-коричневый.Сахарозо-нитратный агар. Рост слабый, спорангий небольшой, субстрат 50ный мицелий перламутрово-розовый,светло-желтый, растворимого пигмента нет.Глюкозо-аспарагиновый агар. Ростсредний, спорангий небольшой. Субстратный мицелий бамбуковый, перла"мутрово-розовый, растворимого пигмента нет. 4Глицерин-аспарагиновый агар, Ростслабый, спорангия нет, субстратныймицелий бамбуковый, перламутрово-розовьп, растворимого пигмента нет.Тирозиновый агар, Рост слабый,спорангия нет, субстратный мицелийсветло-янтарный, растворимый пигментотсутствует.Агар с овсяной мукой. Рост хороший, спорангии средний, субстратныймицелий янтарный, ярко-маисовый,растворимый пигмент отсутствует,Дрожжевой-солодовый агар. Ростхороший, спорангий плохой, субстратный мицелий цвета топаза, растворимый пигмент бледный,Глюкоэо-дрохжевой агар. Рост хороший, спорангий отсутствует, субстратный мицелий светло-коричневый,растворимый пигмент эолотисто-коричневый.Глицерин-нитратный агар. Ростсредний, спорангия нет, субстратный мицелий бесцветный-бамбуковый,растворимый пигмент отсутствует.физиологические свойства.Хорошо усваивает -арабиноэу,О-кислозу, О-глюкозу, О-фруктоэу,О-маннозу, манний 1-рамнозу, сахарозу, крахмал, салицин, галактозу,глицерин, трегалозу, мальтозу, целлобиозу.Не усваивает инозит, 3-лактозу,рафинозу, целлюлозу, 1.-сорбоэу, 1.-мелибиозу, О-рибозу,мелезитоэу, О-сорбит, дульцит,Оптимальная температура роста10-45 С. Снятое молоко пептониэирует и коагулирует. Крахмал гидролизует.Гидролиз целлюлозы отрицательный,Казеин гидролизует.Желатин не разжижает,Тирозин не разлагает.Образует меланин на пептонной црожжевой и железосодержащей агаро вой среде, на тирозиновой агаровой среде меланин не Образуется.Ксантин, гипоксантин не разлагает.Сероводород не выделяет.Нитраты ие восстанавливает.Антибиотический комплекс включает непланоцииы А, В, С, О и Р. Непланоцин А представляет собойслабое основание и имеет следующиеФизико-химические характеристики,25 НО - Н Он ОХ Элементарный анализ.Найдено, 7: углерода 49,96%, водорода 5,00%, азота 26,437.,Вычислено, 7: углерода 50,19%,водорода 4,97%, азота 26,607.Молекулярный вес 263.Молекулярная формула С,Н,03Точка плавления 21 Ь С,2 оУдельное вращение, а.3 = 157 о= 0: 1, К 1=0, 34; этилацетат: метанол: вода=10: 2: 1, И=О, 21; хлороформ: 45метанол: уксусная кислота - 10:2:1,КФ=0,17.Химическая структура Биологические свойства непланоцина А следующие,Активность, подавляющая рост пато.генных грибов растений : 100 /млраствор непланоцина А в чашке с агаровой средой Не 1 я 1 пСЬозрогцщ огугаеМ 0306 характеризуется зоной подавления диаметром 18,9 мм.Противоопухолевая активность.Мьслам внутрибрюшинно вводили 10опухолевых клеток лейкемии сС=1210и спустя день в течение пяти днейвнутрибрюшинно адин раз в день вводили непланоцин А дозировки 0,16 мг/кг0,32 мг/кг, 0,63 мг/кг, 1,25 мг/кг,2,5 мг/кг и 0,5 мг/кг, соответственно), Для эксперимента брали контрольную группу из 10 мышей и по семь мышей в каждой подопытной группе. 1 ри15-дневном наблюдении средняя продолжительность жизни для контрольнойгруппы составила 7,4 дня, Увеличение продолжительности азии для подвергнутых лекарственнои обработке животных по сравнению с контрольнымиживотными равно 158% при дозировкеО,6 мг/кг, 170% при 0,32 мг/кг, в случае введения 2,5 и 5 мг/кг не отмечалось никакой смертности.Аналогичный эффект значительногопродления гияни при лечении непланоцином А наблюдается и в случае асцита опухоли Эрлича, Саркомы 180,лейкемии Р, поражающей мышей икрыс, Саркомы Еошиды. Острая токсичность..О : 13 7 мг/кг (внутрибрюшинно,Я) Вна мышах),Внутрибрюшинное введение в течение 14 дней раз в день дозы 5 мг/кгне вызывало никакой смертности,Для лечения острой лейкемии лекарство следует вводить внутривенно в дозированных формах 5-20 мг/день, растворенное в физиологическом растворе, один раз в день в течение семи дней. Непланоцин А также эффективен для лечения хронической лейкемии, злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта, легочной карциномы, рака матки, рака молочной железы и злокачественной лимфатической лейкемии.Непланоцин А может применяться в виде Физиологически приемлемых солей минеральных кислот или органических кислот, а именно хлоргидрата,906388 ОН 0 н ОН ния 226 С (с Точкем) . л ложе ние.сЦ =-43,шинн вечивание ю бдительная: о ната калия, лпериодата рид железа альдегид и лабое основани астинчатые крис Бесцветные пл лы. ВГ величина И -бутанол:. ук да: 1: 1, 81=0 3 центрированный,вода=10:0,5:2, К концентрированны вода 1 О:1:1, К 1= да 10: 1, 81=0 43 нол: вода=10;2:1 форм; метанол: у 2: 1, Йг=О, 20.он: воат: мета д 30 ацэтилац ЙГ=О 2 ксусная сныи спектр поглощ оропри 342 1545,3120,510,ислота 10 поглощени 168 Р 15 Полос40-288 ацетата, тертрата, цитрата или сукцината.Непланоцин С представляет собойслабое основание и имеет следующиехарактеристики.Элементарный анализ.Найдено : углерода 47,59%,ьодорода 4,647 азота 2510%.Вычислено: углерода 47,37, водорода 4,667., азота 25,05%,Молекулярный вес 279Молекулярная форма С НО111 Ъ 5 4Удельное враще б(КВг).Полосы поглощения при 3450-3100,2920, 2740, 2680, 1680, 1630, 1600,1560, 1500, 1460, 1420, 1380, 1360,1330 1300 240 1200 1170 11001050, 1020, 960, 920, 900, 880, 830,780, 680 см,.Спектр ядерного магнитного резонанса (внутренний стандарт О.з, вдейтеририйдиметилсульфоксиде, 100 МГцРастворим в воде, диметилсульфоксиде, диметилформамиде,Нерастворим в этилпетате, хлороформе, бензоле и гексене Цветная реакция,Поло.пермангаленса.Отрицательная: хлнингидрин, анисовый нашатырный спирт:ИО 19; и -пропанол:й нашатырный спирт: 8Структурная формула Непланоцин С обладает следующими биологическими свойствами,Подавляющая активность роста патогенных грибов растении: 100 Не- япйЬозрогцщ огугае М 0306:31,4 мм (зона подавления) Садозрогця ЬегЬа гцп М 4278: 14,0 мм (зона подавления) АТегпага 1 Ецсйапа М 4588: 12,0 мм (зона подавления)Острая токсичность..Ого. 55 мг/кг (внутрибрю о мышам). Непланоцин С может использоваться в виде физиологически приемлемой соли минеральной кислоты или органической кислоты, такой как хлоргидрат, ацетат, тертрат, цитратили сукцинат.Противоопухолевая активность.Непланоцин С полностью подавляетрост лейкемических клеток -5178 Ув концентрации 08 Д /мл и чйго.При внутрибрюшинном введении вдозах 1 О мг/кг непланоцин С оказывает пролонгирующий эффект в отношении продолжительности жизни при заражении лейкемией .-210 составлящий 1317. от контрольной группы.Непланоцин О имеет следующие физико-химические характеристики.Элементарный анализ, С 49,70%,Н 4,64%,21,20%,Молекулярный вес 264,Молекулярная формула ,Н, 1,д,Точка плавления 236-237 С.Удельное вращение:сД д И906388 сть непланоци Острая ток н обладским следующи Непланоцин Гми фнзико-хнмич ЭлементарныйН 4,83%, И 25,7лиэационную вод Молекулярный Молекулярная Точка плавле оиствами.С 48,74%,ржит кристалакали., (с ) ение.3 =-6З ем), Удельное в =0,8 Н О), УФ спектр в воде: Л 1 глощения 2630 А, Еск =548 по 1440, 390, 1305 12 О, 1110, 1075,1040, 1000, 990, 975, 900, 845,780 смСпектр ИР (внутренний стандартОц, в дейтерийдиметилсульфоксиде,1 ОО МГц),Растворим в воде, диметилсульфоксиде, диметилформамиде, уксусной кислоте и пиридине.Нерастворим в этиловом эфиреуксусной кислоты, хлороформе, бенэоле и гексане,Цветная реакция.Положительная: обесцвечивает перманганат калия и окисляет перйодат.Отрицательная: нингидрин, Фелинга и хлорид железа.Белые игольчатые кристаллы.:1:1, К 1=018 ацетон: вода;1,К=О,ЗЗ.Структурная формула При интраперитониальном введениимьппам непланоцина Д в количестве100 мг/кг не отмечается никакогосмертельного исхода,Непланоцин В имеет следующие физико-химические характеристики.Элементарный анализ. С 47,44%,Н 4,63%, И 25,07%.Молекулярный вес 279.Молекулярная формула СН М 0 .Точка плавления 269-272 С (с разложением) .24Удельное вращение Гс 3 =-35(Квг) .5 Полосы гоглощения при 3380, 3280,3100, 2920, 2880, 2740, 1700, 1610,1570, 1520, 1480, 1420, 1380, 1350,1300, 1250, 1220, 1170, 1160, 100,1080 1030 1020 980 970 870 10 840 790 730 710 см-Спектр ЯМР (внутренний стандарт0в дейтерийдиметилсульфоксиде,100 МГц) .Растворим в воде, диметилсуфок сиде.Нерастворим в этилацетате, хлороформе, бензоле и серном эфире,Цветная реакция.Слегка положительная: обеспечива- О ет перманганат калия.Отрицательная: нингидрин, Молина и анисовый альдегид.Слабое основание.Белие пластннчатые кристаллы. 5 К 1 величина.Н -бутанол: уксусная кислота: вода:1:1, КГ=О 42 Н -бутанол: концентрированный нашатырный спирт:вода:0,5:2, И=О 27, Н -пропанол: 30 концентрированный нашатырный спирт;вода:1:1, КГ=О 41; ацетон: вода 10:1;1, И=О 48.Структурная формула вес 263формула СНМ.О, НОия 223 С 1 с раэложе25 Н 0 - Нг ОННепланоцнн В и Г имеют следующие биологические свойства.Острая токсичность.Интрапарентеральное введение мышам непланоцина В или Г в количестве 100 мг/кг не вызывало смертельного исхода.Подавление роста клеток,Непланоцин В в количестве 0,8/мл и непланоцин Г в количестве 20"/мл подавляют рост клеток лимфомы с 1- -5178 уПри внутрибрюшинном введении непланоцина В в количестве 50 мг/кг препарат оказывает пролонгирующее 1 9063в кислой воде одна капля 0,1 =2600 Аф Е см =527,1, н,НС 1); в щелочной воде (одна капля 0,1=,ф еЛх =2630 А, Е =531,8 н.1 аОН), 5Инфракрасньш спектр поглощения (КВг) .11 олосы поглощения при 3320, 3210, 2920, 1650, 610, 1580, 1480, 1420, 1380, 1340, 1310, 1270, 1220, 1180, 1110, 1070, 1020, 980, 900, 840, 800, 730 см".Спектр ЯМР (внутренний стандарт О , в дейтерийдиметилсульфоксиде, 100 Мц),5 Растворимость, Растворим в воде, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте,Нерастворим в этилацетате, хлороформе, бензоле и серном эфире.20 Цветная реакция. Положительная: обесцвечивает перманганат калия.Отрицательная: хлорид железа, нингидрин и Фелинга, Природа. Слабое основание. Белые игольчатые кристаллы. КГ Величина. Н-бутанол: уксусная кислота: вода 6;1;, 81=0,51; Н -бутанол: концентри- ЗО рованный нашатырный спирт: вода: 0,5:2, ВГ=0,43, Н -пропанол; концентрированный спирт: вода:1;1, 81=0,59; ацетон: вода:1, КГ=0,48. Структчоная формулаМ 88 12действие на срок жизни - 142% от контрольной группы.Непланоцин оказывает антидепрессивное действие,Антибиотический комплекс, включающий непланоцины А., В, С, О и Гполучают, например, путем инокулирования штамма вида Ашрц 11 аге 11 аА 11079 ГЕЮ 1-Р4494 в подходящей питательной среде. Микроорганизмы могут выращиваться различнымиспособами в искусственной среде илиестественной среде, жидкой или твердой культуре. При промышленном получении предпочтительна жидкая среда.Для составления среды могут применяться усваиваемые источники углерода,источники азота, неорганические солии другие вещества, и эта среда применяется для микроорганизмов, производящих антибиотики непланоцины,В качестве источника углерода можно применять глюкозу, сахарозу, глицерин, растворимый крахмал и томуподобные материалы. В качестве источника усваиваемого азота могутприменяться пептон, порошок соевыхбобов, экстракт пшеницы, мясной экстракт, рисовые отруби, гидролизатказеина натрат, аммониевая сольи т.п. Могут также применяться такиенеорганические соли, как хлористый натрий, фосфат (кальция, магния, железа или марганца). Можетдобавляться противопенное вещество,такое как силиконовое масло или соевое масло.В случае жидкой культуры предпочтительно применяется погруженнаяаэрируемая культура. В этом случаевыращивание осуществляют при оптимальной для микроорганизмов температуре, предпочтительно 25-300 С.Продолжительность выращивания зави -сит от применяемых условий и обычно равна 2-4 дням. рН среды при выращивании регулируется от нейтральной до слегка кислой. Такая среда содержит антибиотики-непланоцины. Выделение антибиотиков-непланоцинов осуществляют стандартным выделением.или отделением - способами, применяемыми для выделения продуктов обмена микроорганизмов. Так как непланоцины представляют собой слабые основания они могут быть выделены путем поглощения приемлемыми адсорбентами с послеНепланоцин А также может быть получен из непланоцина О через производные непланоцииа О.Для этого три гидроксильные группы в циклопентеновом кольце непланоцина О взаимодействуют с бензоил" хлоридом, Гидроксильную группу в адениновой структуре непланоцина О заменяют маркапто-группой, для чего осуществляют реакцию например,50 дующим элюированием подходящимрастворителем. В качестве адсорбентовмогут применяться активный углерод,катионо-обменные смолы, активированный глинозем или силикагель. Элвирувщие растворители выбирают в зависимости от применяемого адсорбента, например это могут быть смешивающиеся с водой органические растворители, такие как водный метанол, 1 Оводный ацетон или водный диоксан,или растворы солей, или кислые щелочные растворы, Кроме того, непланоцины могут выделяться и очищаться каквещества слабощелочной природы. Например, антибиотики поглощают катионо-обменной .смолой, такой как Амберлит 1 ВРили Доувек 50 и элюирувт приемлемым кислым, щелочнымили солевым раствором, 20Для выделения, элюирования и очистки антибиотиков предпочтительноможет применяться сочетание адсорбента и ионо-обменной смолы. Например, фильтрат культуры загружают в 25катионо-обменную смолу Амберлит1 Кдля поглощения антибиотика,элюируют щелочным раствором, рН 3,7нормальным водным раствором аммиака,с получением активной фракции, и пос- ЗОле регулирования рН до нейтральнойили слабо щелочной среды антибиотики адсорбируют активированным углемс последующим элоированием 0%-нымметанолом. Элюат адсорбируют анионо-обменной смолой Амберлит 1 ВА и вновь элюирувт водой для сбораактивных фракций. Обьединенные фракции концентрируют, получая сырой продукт, который затем подвергают очистке на силикагеле. Дальнейшую очистку осуществляют перекристаллизацией.Чистота может быть определена по единственной точке плавления или единственному пятну на бумажной хроматографии, тонкослойной хроматографиии бумажном электрофорезе при 2630 АУФ-света,с пятисернистым фосфором, затем удаляют защитную группу для гидроксильнсй группы, в результате получают производное непланоцина О. Метили" рованием его метилйодидом получают производное непланоцина О. Производное непланоцина О обрабатывают метанольным аммиаком, в результате получают непланоцин А.Кроме того, три гидроксильные группы в циклопентеновом кольце непланоцина О получают путем ацелирования. Это достигается путем взаимодействия с уксусным ангидридом. Затем указанное соединение превращают в производное непланоцина О путем взаимодействия с хлористым тионилом. Производное непланоцина О может превращаться в непланоцин А через производное непланоцина О путем обработки метанольным раствором аммиака.11 р и м е р 1, В колбу емкостью 500 мл загружают 100 мл водной среды (рН 6,5), содержащей 2% глюкозы, 2% крахмала, 1% дрожжевого экстракта, 1% гидролизата казеина и 0,2% карбоната кальция. Содержимоео колбы стерилизуют 15 мин при 120 С. Ь две колбы этой среды высевают одну петлю со скошенной культурой вида Ащрц 11 аг 1 е 11 а А 1)079 РЕЮ-Р Р 4494 и встряхивают при 30 С. Через четыре дня культуральну: среду переносят в 20 л такой же стерилизованной среды, которая находится в бродильном чане, емкостью 30 л и вырашивают при 30 С при перемешивании с 300 об/мин и аэрировании 20 л/мин в течение 48 ч. Выращенную таким путем среду переводят в 200 л водной среды( рН 6,5) содержащей 4% глюкозы, 1% порошка соевых бобов, 0,4% мясного экстракта, 0,4% пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,25% хлористого натрия и 0,1% карбпната кальция и я 11 раиивают при 30 С при перемешивании со,180 об/мин и аэрирование 130 л/мин в течение 40 ч. Полученный бульон (примерно 200 л) фильтруют, и гриб- ницу промывают водой. Фильтрат и промывочную воду объединяют, в результате чего получают примерно 140 л прозрачного фильтрата (активность 57 мкг/мл как непланоцин А).П р и м е р 2. Полученный в примере 1 фильтрат пропускают через ко 15 906 лонку с 20 л катионо-обменной смолы Амберлит 1 Р(Н+ тип), где происходит адсорбция материала, затем колонку промывают 100 л воды.Элюирование производят нормальным водным раствором аммиака, рН 3,7Начальный элюат (30 л) сбрасывают, 90 л последующего .:.элюата собирают, доводят рН его до 8 добавлением 6 н. соляной кислоты, затем пропускают через 4 л активированного угля в колонке, промывают водой, элюируют 90 л 70 -ным метанольным раствором, Полученный элюат концентрируют при пониженном давлении, получая 1,5 л концентрата. Концентрат вводят в колонку, заполненнув 10 л катионообменной смолы Амберлит 1 РА(ОН типа) и элюируют водой. Добавлением 4 н. соляной кислоты регулируют рН до 7. Элват концентрирувт в вакууме, осаждают материал при охлаждении и фильтруют, получая 41,8 г сырого непланоцина А (чистоты примерно 12 ).Неочищенный непланоцин А (41,8 г) растворяют в малом количестве воды и вводят в колонку (8,340 см), заполненную 2 л силикагеля со смесью растворителей - н-бутанол: 283-ный водный аммиак: вода=10:0,2:1 и затем элюирувт той же смесью растворителей. Отделяют каждые 150 мл фракции, актиьные фракции соответствуют фракциям РР 24-52, Их собирают, концентрируют в вакууме и выдерживавт при охлаждении. Осадок отфильтровывают, получая 2,6 г сырого кристаллического непланоцина А (выход 32 ).Сырой непланоцин А растворявт примерно в 60 мл горячей воды и выдерживают при комнатной температуре. Выделившиеся в осадок белые игольчатые кристаллы отфильтровывают, получая 2,0 г кристаллов непланоцина А (выход 25,2 ). П р и м е р 3. Фильтрат (140 л, активностью 300 мкг/мл как непланоцин С), приготовленный в соответствии с той же методикой чтои в примере пропускают через колонку с 20 л катионо-обменной смолы Амберлит 1 Й(Н типа) для адсорбции мате 4риала и затем промывают примерно 100 л воды, Элюирование осуществляют нормальным водным раствором аммиака рН 3,7, начальный элюат (20 л) сливают. Затеи собирают 100 л по 388 16 следующего элюата, регулируют рН до8 путем добавления концентрированнойсоляной кислоты, пропускают черезколонку с 4 л активированного угля,промывают водой, элюируют 70 л70%"ным раствором метилового спирта.Полученный элюат концентрируют припониженном давлении, получая 1,5 лконцентрата. Концентрат сушат при1 о температуре ниже О С, в результате.получают 83,6 г сырого порошка (чистотой 29,5 Х).83 г сырого порошка .растворяютв водном насыщенном растворе И-бу 15 тилового спирта и вводят в колонку8340 см, загруженную 2 л силикагеля с н-бутиловым спиртом, а затем элюирувт смесью растворителей -н-бутанол: концентрированный, вод 20 ный аммиак: вода:0,2:1. Отделяюткаждую фракцию объемом 150 мл, Активные фракции соответствуют фракциям РР 53-108, их собирают, концентрируют и выдерживают при низкой тем 25 пературе. Осадок отфильтровывают, получая 18,2 г непланоцина С в видебелого кристаллического вещества(чистота 96 , выход 41,6 ),Продукт растворяют в горячей во 511 де и выдерживают при комнатной температуре. В осадок выпадают бесцветные пластинчатые кристаллы непланоцина С. Фильтрованием получают чистый непланоцин С.П р и м е р 4. К фильтрату, приготовленному в соответствии с методикой примеРа 1, добавляют 3,6 кгпорошка активированного угля. Послеперемешивания в течение 40 мин акти 0 вированный уголь отфильтровываюти тщательно промывают водой. Элюирование осуществляют 70%-ным метанольным раствором. 40 л элюата су -шат в вакууме, получая 80 г сырого порошка, содержащего непланоцин О.В колонку, заполненную 6 л силикагеля со смесью растворителей - н-пропанол: концентрированный водный раствор аммиака: вода:1:1, вводят80 г сырого порошка и затем элюиоуютего той же смесьв растворителей. Фракционируют каждые 600 г элюата, Непланоцин 0 наиден во фракциях РР 20-37.Указанные активные фракции собирают,концентрируют в вакууме до 30 мл55 и выдерживают при охлаждеции. Фильтрованием отделяют осадок, в результате получают 460 мг сырого кристаллического непланоцина О.