Способ получения фитогемагглютинина

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОГЕМАГГЛЮТИНИНА путем экстракции измельченных семян фасоли в кислой среде с последующим осаждением экстракта, стерилизующей фильтрации и сублимационной сушки, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени процесса и повышения специфической активности, экстракцию проводят буфером Мак-Ильвейна при pH 2,6-3,2 и соотношении сырье: экстрагент 1 4 6, а осаждение экстракта проводят трехкратно ацетоном при соотношении экстракт: осадитель 1 0,4 0,6 0,75 1,5 0,75 1,75 соответственно.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения фитогемагглютинина.
Известны способы получения веществ, обладающих митогенной активностью (авт. св. СССР N 1131506), путем экстракции тонко измельченной муки фасоли сорта "Красногвардейская" водой, подкисленной концентрированной соляной кислотой до рН 1,0, в присутствии антиоксиданта с последующим фракционным высаливанием кристаллическим сульфатом аммония, диализом, очисткой колоночной хроматографией на сефадексе G-100 и сублимационной сушкой целевого продукта. По сравнению с заявляемым описываемый способ более длителен, стадия очистки сложна по исполнению, целевой продукт, получаемый по этому способу, нестерилен, что значительно сужает область его использования.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения фитогемагглютинина путем экстракции измельченных семян фасоли белой 0,1 н. раствором соляной кислоты с последующим осаждением сульфатом аммония, диализированием, стерильной фильтрацией и лиофильной сушкой (ТУ 6-09-10-437-75).
Недостатком этого способа является длительность процесса, недостаточно высокие специфическая активность и выход целевого продукта, получаемого по способу-прототипу.
Целью способа является повышение специфической активности и сокращение времени.
Поставленная цель достигается тем, что измельченные семена экстрагируют в кислой среде с последующим осаждением экстракта, стерилизующей фильтрацией и сублимационной сушкой, причем, согласно изобретению, семена фасоли сорта "Гайдарскаая" экстрагируют буфером Мак-Ильвейна при рН 2,6-3,2 и соотношении сырье: экстрагент 1: 4-6, осаждение экстракта проводят ацетоном трехкратно при соотношениях 1:(0,4-0,6):(0,75-1,5):(0,75-1,75).
П р и м е р 1. 1 кг семян фасоли сорта "Гайдарскаая" измельчают до состояния муки. Экстракцию проводят 5 л экстрагента с рН 3,0 (буфер Мак-Ильвейна) в течение 2 ч при перемешивании в обычных условиях. После отделения шрота от экстракта последний осветляют на центрифуге при 3000 об/мин в течение 20 мин. Полученный экстракт 3,3 л осаждают при перемешивании 1,65 л холодного ацетона (Т=4^оС). Смесь оставляют в холодном месте (Т=4^оС) на 30 мин. Надосадочную жидкость декантируют, а осадок отделяют на центрифуге (30000 об/мин) в течение 20 мин. Полученный осадок отбрасывают. К раствору вновь прибавляют при перемешивании 4,95 л холодного ацетона и оставляют для образования осадка на 1 ч в холодном месте при Т=4^оС. Затем декантируют надосадочную жидкость, осадок отделяют на центрифуге при 3000 об/мин в течение 2-3 мин и растворяют в 700 мл дистиллированной воды. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин, затем отбрасывают, а к надосадочной жидкости прибавляют 700 мл холодного ацетона. После отстаивания в течение 30 мин в холодном месте при 4^оС осадок отделяют центрифугированием, растворяют в центрифужных стаканах в 600 мл воды. Осадок отделяют, а надосадочную жидкость высушивают сублимацией в вакууме в условиях, создающих стерильность работы. Раствор перед этим пропускают через микропористые капроновые мембраны с размером пор 0,3-0,8 мкм и один слой фильтровальной бумаги. Фильтрат в стерильных условиях разливают по 1 мл во флаконы. Предварительное замораживание проводят в течение 5-6 ч при Т=-(25-30)^оС.
Сушку проводят при 30^оС до полного удаления влаги во флаконах. После этого флаконы закрывают резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками. Выход после одной загрузки составляет 6,4 0,3 г фитогемагглютинина с активностью 450 40 митотических пластин на 0,2 мг препарата.
В последующих примерах при описанных выше режимах менялось влияние рН экстрагента на митогенную активность и выход целевого продукта. Результаты по выходу и активности приведены в табл. 1.
Как показано в табл. 1 прирост митогенной активности наблюдается параллельно с увеличением выхода целевого продукта в кислой области и захвата в препарат сопутствующих гликопротеинов.
В последующих опытах (10-17) при описанных выше режимах показано влияние соотношения сырья и экстрагента на митогенную активность и выход целевого продукта. Как следует из данных, приведенных в табл. 2, оптимальным значением, способствующим получению целевого продукта с наибольшей активностью и выходом являются соотношение 1:5.
В примерах 18-25 (см. табл. 2) представлена зависимость митогенной активности и выхода ФГА от объема ацетона, взятого для первого осаждения. Фракционное отделение сопутствующих гликопротеинов позволяет достичь максимума активности при соотношении 1:0,5. Дальнейшее снижение активности и увеличение выхода целевого продукта можно объяснить за счет попадания в препарат сопутствующих веществ с большей молекулярной массой.
В примерах 26-31 (см. табл. 4) представлены данные по влиянию объема ацетона на митогенную активность и выход целевого продукта при втором осаждении. Несомненно, что оптимальный объемом, позволяющим достигнуть максимальной митогеннной активности, является соотношение смесь-растворитель 1:1. Последующее увеличение приводит к уменьшению активности целевого продукта.
Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что при осуществлений заявляемого способа значительно сокращается время его проведения, повышается специфическая активность целевого продукта при одновременном сохранении/увеличении его выхода.
При этом необходимо отметить, что продукт, полученный по заявляемому способу, хранится в течение 1,5 лет без изменения специфической активности в отличие от ФГА, полученного по способу-прототипу. Га- рантийный срок хранения ФГА 6 месяцев со дня изготовления (ТУ 6-09-10-437-75, лист 10).
Фитогемагглютинин находит применение при проведении научно-исследовательских работ, например, для получения реакции бласттрансформации лимфоцитов и стимуляции их митотического деления в культуре лимфоцитов периферической крови человека.
Использование: изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения фитогемагглютинина. Целью изобретения является сокращение времени процесса и повышение специфической активности. Сущность изобретения заключается в экстракции измельченных семян фасоли буфером Мак-Ильвейна при pH 2,6 - 3,2 и соотношении сырье: экстрагент 1 :(4 - 5), в осаждении целевого продукта последовательно трехкратно ацетоном при соотношении соответственно экстракт: осадитель 1 : 0,4 - 0,6 - 0,75 - 1,5 : 0,75 - 1,75, стерилизующей фильтрации и сублимационной сушке. Положительный эффект заключается в повышении специфической активности с 300 до 440 ед и сокращении времени с 53 ч до 8 ч 30 мин. 6 табл.