Способ получения антисыворотки к адреналину

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К АДРЕНАЛИНУ, включающий обработку адреналина ангидридом, конъюгацию его с белком-носителем, иммунизацию животных и сепарацию сывороток, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности целевого продукта, перед конъюгацией адреналин обрабатывают янтарным ангидридом и конъюгацию с белком-носителем проводят при соотношении числа молекул 600 1500 1.

Изобретение относится к иммунохимии, в частности к способам получения специфических антител к адреналину, и может быть использовано в медицине для разработки метода определения катехоламинов в целях диагностики, а также научных целях.
Целью изобретения является повышение специфичности целевого продукта.
Сущность способа состоит в иммунизации животных конъюгатом гаптен-белок, полученным при связывании защищенного по алифатической аминогруппе адреналина и белка в соотношении 0,3 М адреналина и 0,2-0,5 мМ бычьего сывороточного альбумина. Реакцию защиты вторичной аминогруппы адреналина проводят в насыщенном янтарным ангидридом растворе метанола, что позволяет получить надежную защиту аминогруппы. Воспроизводимость связывания адреналина с белком при этом составляет до 90%
П р и м е р 1. 1 мМ lepinephrine (фирма Signea) суспендируют в 5 мл обезвоженного метанола, и добавляют 1,5 г янтарного ангидрида. Инкубацию проводят в течение суток. После высушивания метанола на роторном испарителе осадок отмывают от избытка ангидрида бензолом 3 раза по 5 мл.
Синтез конъюгата адреналина (бычий сывороточный альбумин). 100 мМ (0,3 м/л) сукционированного адреналина растворяют в 1 мл 3-молярного ацетатного буфера рН 6,0. В 1 мл 0,3-молярного раствора NaHCO₃ растворяют 50 мг (0,05 мМ белка и по каплям приливают к первому раствору при постоянном перемешивании. Через 2-3 мин также по каплям к смеси добавляют 1 мл 7,5% формальдегида. Реакцию проводят в атмосфере азота в герметически закрытой пробирке 3 сут. при комнатной температуре. Пробу конъюгата диализуют против фосфатного буфера рН 7,2, а для снятия защиты конъюгат подвергают гидролизу (в атмосфере азота) в течение 1 сут. при 60^оС. Диализ проводят в фосфатном буфере при рН 7,2.
Молярное число рассчитывают как отношение концентрации гаптена к концентрации белка. Концентрацию гаптена измеряют в реакции Doty, белка в реакции Лоури. При описанном соотношении гаптен/белок молярное число равно 18.
П р и м е р 2. Защиту вторичной аминогруппы адреналина проводят, как в примере 1.
Синтез конъюгата. 100 мг (0,3 м/л) N-сукцинированного адреналина растворяют в 1 мл 3-молярного ацетатного буфера рН 6,0. В 1 мл 0,3-молярного раствора NaHCO₃ растворяют 20 мг 0,2 мМ (л) белка (соотношение гаптен-белок 1500:1) и по каплям приливают к первому раствору при постоянном перемешивании. Через 2-3 мин также по каплям к смеси добавляют 1 мл 7,5% формальдегида. Инкубацию реакционной смеси проводят 3 сут при комнатной температуре. Все остальные условия те же, что в примере 1. Молярное число при концентрациях белка и гаптена, использованных в примере 2, составило 20.
Подвижность белка в конъюгатах проверяли в электрофорезе на ацетат-целлюлозных мембранах по сравнению с подвижностью нативного бычьего сывороточного альбумина (ВSA) и контрольного конъюгата (КК-ВSA), где ВSA обработан параллельно с конъюгатом, но без введения в реакцию гаптена. Увеличение подвижности ВSA в конъюгатах (КГ) оценивалось как показатель его связывания с гаптеном.
Иммунизация кроликов. Для иммунизации используют КГ адреналин (бычий сывороточный альбумин/КГА-BSA), полученный в примере 1, с молярным числом 16-18, и в примере 2 с молярным числом 18-20. Кроликов породы Шиншилла иммунизируют следующим образом.
Первая инъекция (по 0,1 мл раствора КГ-А-ВSA + полный адъювант Фрейнда с концентрацией белка 1 мг/мл) в подушечки задних лап.
Через каждые 5 дней (по 0,1 мл того же раствора) инъекции: 1) в область подколенного лимфоузла; 2) внутримышечно в область бедра; 3) в область подлопаточного лимфоузла, 4) в конъюнктиву обоих глаз.
Через 15 дней в 6 точек внутрикожно по 0,05 мл конъюгированного гаптена бед адъюванта и через 2 ч внутривенно в краевую ушную вену. Взятие крови на 6-8 дни.
Наличие антител в различных порциях антисыворотки проверяют реакцией преципитации в агаре по методу Оухтерлони. Антисыворотка против адреналина после 5-7 реиммунизаций дает специфические полосы преципитации с КГ-А-BSA, в то время как с КК-ВSA полосы преципитации не обнаружены.
Проверка специфически полученных антисывороток радиоимунным методом.
Специфичность антисыворотки против адреналина проверяли с помощью А (H³). Для связывания А (Н³) использовали преформированные преципитаты иммуноглобулина исследуемой кроличьей сыворотки с антиглобулином. Полученные преципитаты инкубировали с меченым по тритию адреналином, отмывали центрифугированием до постоянного уровня активности и добавляли возрастающие концентрации стандартов адреналина, норадреналина, дофамина ДОФА, нетанефрина, норметанофрина и тирамина.
При этом происходит вытеснение метки, которая переходит в надосадок. Стандарт адреналина конкурирует со связанными А-(Н³) в концентрации 50-0,5 мг/мл.
Из представленных данных можно сделать заключение об отсутствии выявляемых в РIA антисывороткой против адреналина реакций между адреналином и другими веществами катехоловой структуры.
Проверка специфичности полученной антисыворотки методом ИФА.
Далее оценку специфичности антисыворотки проводили с помощью гетерогенного иммуноферментного анализа (ИФА) в варианте количественной нейтрализации с использованием иммуноферментной метки против глобулинов сыворотки кролика.
При анализе иммунных и неиммунных сывороток с конъюгатом на основе СИТФ было установлено, что уровень неспецифического связывания составил 5-10% В связи с этим в дальнейшем были использованы конъюгаты на основе RSA, уровень неспецифического связывания для которого не превышал 1% В качестве контроля применен КГ КК-RSA, который дает уровень фона 0-0,001%
В тест-системе на базе ИФА определяемые концентрации стандарта адреналина составили 10⁸-10² пкг/мл пробы. Рабочее разведение антисыворотки против адреналина было 2 10⁴.
Оценку перекрестной специфичности антисыворотки против адреналина к норадреналину, дофамину, ДОФА, метанефрину, нормеетанефрину и тирамину выражали как отношение адреналина к конкурентному веществу при 50% торможении.
Антисыворотка против адреналина не дает перекрестных реакций с норадреналином и метанефрином, перекрестные реакции с дофамином (0,01% перекреста) не мешают определению адреналина в описанной тест-системе.
Положительное качество полученной антисыворотки против адреналина отсутствие перекрестных реакций дает возможность применить антитела к адреналину для определения его в биологическом материале иммунологическим методом.
Изобретение относится к иммунохимии, касается способа получения спефических антител к адреналину, предназначено для разработки метода определения катехоламинов в диагностике и в научных целях. С целью повышения специфичности целевого продукта лабораторных животных иммунизируют конъюгатом гаптен-белок, полученным при связывании защищенного по алифатической аминогруппе адреналина и белка в соотношении 0,3 М адреналина и 0,2 0,5 мМ бычьего сывороточного альбумина. Реакцию защиты вторичной аминогруппы адреналина проводят в насыщенном янтарным ангидридом р-ре метанола, что позволяет получить надежную защиту аминогруппы. Воспроизводимость связывания адреналина с белком 90%