Способ количественного определениябелка b биологической жидкости

ОП ИСАНИ Е ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советсинк. Соцналнстическнк Респубпнн и 1805146 юменский государственный медицинский инстйгут,) Заявнтел 54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 5 ЕЛК В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ тыва ют водным та натрии и едк обработкой иову вом Фолнна-Че фотом етрирован ного соединения аствором с си карбонаоследующей о натри нного р вора реакти 9,8-10,2 и го окрашен околте прн р ем получен Изобретение относится к биохимии и может быть использовано при определении белка в крови, акстрактах тканей и органов, в белковых препаратах.Известен способ определения белка в биологической жидкости путем обработки пробы анализируемой жидкости водным раствором смеси карбоната:натрия и ед кого натрия с последующей обработкой полученного раствора реактивом фолина-Че 1 О околте н фотометрированием полученного окрашенного соединения 1.Недостатком способа является его невысокая точность, сложность, связанная с тем, что некоторые восстановителн не 15 белковой природы способны восстанавливать фосфомолибдатвольфрамовую гетерополикислоту, увеличивая интенсивность окраски гетерополисини и искажая результаты определения белка.Бель изобретения состоит в повышении точности способа и его упрощении.Указанная цель достигается тем, что пробу анализируемой жидкости обрабаОтличительная особенность способа состоит в том, что обработку реактивом Фадина-Чеоколте ведут при рН 9,810,2. Реактив Фолнна-Чеоколте является сложной смесью фосфомолибдатвольфрамовой, фосфомолибденовой и фосфовольфрамовой гетерополикислот, обладаквцих раэлия ным окислительно-восста ловите пьным потенциалом, рН - оптимумом устойчивости й спектрофометряческими характеристиками образующейся гетерополисини. Максимум поглощения фосфомолибдатвольфрамовой гетерополикислоты 640-740 мм, кривая поглощения является результирующей кривых фосфомолибденовой и фосфовольфрамовой попикислот и их полисинью, оптимум устойчивости и максимальный окислительно-восстановитепьный потенциал находится в пределах рН 6,1-10,7.В процессе восстановпения гетеропопикислоты происходит постепенная нейтрализация щелочных компонентов гидроли зующей смеси киспыми компонентами реактива Фолина-Чеоколте, При этом в состав гидролизующей смеси входят ингра. диенты с раздичным рК- от рК 10 З едкий натрий) и 10 (рК 1 входящего в со 10 став реактива карбоната натрия) до 10 (рК карбоната натрия) и, следовательно, в ходе реакции в зависимости от соотношения количеств щелочной гидролизирующей смеси и кислого реактива фоцииа-Че окопте рН среды может стабилизироваться в широких пределах 13-7-10,2. Это, .в свою очередь, может обеспечить неадекватность процесса восстановпения фосфомолибдатаольфрамовой гетерополикис о лоты с преимущественным вовпечелием в процесс восстановления фосфомолибденовой нли фосфовольфрамовой поликислот с соответствующим изменением спектральных характеристик получаемых гетеропописинвй25 и, в конечном итоге, к искажению результатов определения количества восстановителя ( белка). Следовательно, для того, чтобы обеспечить 1 восстановление только одной из поликислот, входящих в состав реактива Фолина-Чеоколте, и стабильность епектрапьных характеристик, реакцию необходимо вести с таким расчетом, чтобы к концу проведения анапиза киспотнощепочное состояние ее стабипизировапось35 в,определенном пределе - это обеспечит постоянство вовлечения и реакцию одной иэ .смеси поликислот и устойчивость образующейся гетерополисини.Зто достигается эквимоляркой нейтра 40 лизацией щелочных и кислотных компонен.тов гидролизую 1 цего реактива (смесь карбоната натрия и едкого натрия (1), и раствора Фолина-Чеокоате, диссоциацией в этих условиях иона НСО - имеющего рК 10 и рН 10,2, 0,6 мл реактива Фолина-Ч еоколте, разведенного до кислотности,в 2,24 раза превышающей шелочность реактива 1), полностью нейтра лиэуют едкий натрий с рК 10, входящий в состав 2 мл реактива 1), и карбонатэьнатрия с рН 10, В этих условиях рН смеси стабилизируется в предепах 10- 10,5 за счет диссоциации иона НСО, что обеспечивает избирательность восстановления фосфомолибдатвопьфрамовой ге 4терополикислоты, стабильность спектральных характеристик и оптической плотности образующейся гетеропописини, воэможность проведения реакции при вь 1 сокой температуре, ускоряющей процесс восстановления. В этих условиях достигается избирательность восстанозпения гетерополикислоты циклическими аминокислотами; цистинцистеин, в концентрациях 100 мг на 100 мл раствора белка, аскорбиновая кислота и сахароза, в концентрациях 500 мг на 100 мл белка заменяют процессу восстановления, В этих условиях1также исключается 11 еобходимость связывания бепка в биуретановый комппекс, что позволяет исключить из анализа этот этап, а следовательно, упростить проведение реакции. П р и м е р 1.Реактив фолина-Чеоколте;100 г аольфрамовокислого натрия и 25 г мопибденовокислого натрия растворяют а 700 мп дистиллированной воды, добавляют ВО мл 88% фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислОты, Смесь кипятЯт а круглодоне 10 й кол бе,снабженной"; обратным холодильником, а течение 10 ч. Полученный реактив оттитроаыва 1 от по фенолфталеину ипи под контролем рН метра реактивом 1. Рабочий раствор готовят путем разведения реактива 2 дистиллированной водой до кислотности, а 2,24 раза превышающей щепочность реактива 1.. Исследуемый раствор белка (сыворотка, ппаэма, экстракты органов и тканей, растаорь 1 белковых препаратов - разведенные до содержания не более 10 мг бенка нд 1 мп раствора).П р и м е р 2.,0,2 мп исследуемого раствора белка вносят в 2 мп реактива 1, пробы выдерживают 10 мин в кипящей водяной боне, Охлаждают и вносят 0,5 мл рабочего раствора 2. 11 ополнительцо выдерживают в кипящей водяной бане 40 с, охпаида 1 от и фотометрируют при 640-740 н а кюветах 3 мм. Найденную оптическую плотность проб сопоставляют со стандартным графиком зависи мости оптической плотности от концентрации белка.При проведении анализа данным методом окрашенный комплекс сохраняется а течение 48 ч, разрешающие способности метода2 микрограмма белка а 0,2 мл раствора.805146 Таблица 1 Мешающие влияния различных добавок при определении. концентрации белка сравниваемыми методами В 252 + 4 ю 1 . 200+ исте ОО Бисти 86 +4,3 222 й 2,4 00 иптоф 20+ 6.,0 201+ 4 5 скорбнновая кислота 210+4,4 200 + Сахароза Вода (контрольны показатели белка 00+2,6- статистически достоверные отличия от ольных показател нение нюю о ( У% та ли 101 16 6 в 7 Оз 32 О 128 4,0 8 е 5, Ое 544 01217 6 8 0,5 0,252 ,25 0,188 Показатели оптической плотности проб при определении концентрации белка дец ным методом выше, чем при определении методом Лоури, что позволяет уменьшить ширину колориметрируемого слоя с 10 до 3 мм. Закон Лам берта-Вера сохраняется как в предлагаемом методе, так и в методе Лоури до концентрации белка.1%. Растворы с большей концентрацией необ ходимо перед определением разводить, Были приготовлены растворы человеческого альбумина с содержанием 20, 40, 60, 80, 100, 200, 600 и 800 микрограммбелка в пробе. В каждом из разведений в 6 параллелях определяют содержание белка данным методом и способом Лоури. В целях стандартизации условий фотометрированим в обоих методах применены кюветы 3 мм, а дляудобства расчетов единицы свето-поглощения выражали в целых чис лах,Результаты определения оптической плотности растворов белка в каждом из разведений цодвергапи статистической обработке, расчитывая среднеарифметический показатель (М), квадратическое отклоединичного определения ( 0 ), средшибку (Ич), и коэффициент вариации ). Полученные данные приводятся в,48 2 2,97 ется в течение 40 сохраняется неиэме и более, что позвопя , пробы в пюбой отре разования цветного с кипячения проб и ным в течение 48 ч.ет фотометрировать ок времени после обкомплекса. м з е и я Источипринятые во1. Пушкинаоды исследовас. 10 (прототип ки информации, нимание при эксперт . И. Биохимически ия, Медгиз, 1963,е едпа Ф разуПодписи аж ППП фПатектф, г, Ужгород, ул. Проекти 0 8,7 0,278 0,1 Средняя величина коаффициентавариацииДля определения 60 пробданным методом понадобилось 54 мин, опредецение того же количества проб методом Лаури 56 потребовало 196 мин времени.Анализ попученных данных показывает, что интенсивность образования окрашенного комплекса существенно не бтличается в обоих сравниваемых методах, но ко" 35 аффициент вариации в предлагаемом методе в 2 раза меньше, чем в методе Лоури.Таким образом, положитепьная аффек-.тивность метода по сравнению с прототи пом (методом Лаури), закпючается в по вышении воспроизводимости попучаемых результатов, сокращении более чем в 3 раза времени, необходимого для проведе ния. одного и того же количества авалиэов, сокрашении количества операций в 4 анализа и количестве нужных реактивовКроме, того, в методе Лаури, нарастание интенсивности окраски проб продолжается в течение 6 ч и фотометрирование их в сроки, отличные от рекомендуемых мета дикой (через 30-40 мин поспе смешения инградиентов) может привести к искажению результатов определения. В пре гаемом методе цветной комппекс об ВНИИПИ Засаз 10868 Способ количественного определениябелка в биологической жидкости путем об-.работки пробы анапизируемой жидкостиводным раствором смеси карбоната натрия и едкого натрия с последующей обработкой полученного раствора реактивомфолина-Чеоколте и фотометрированием полученного окрашенного соединения, о т л ыч а ю щ и й с я тем, что, с целью повыщения точности способа и его упрощения,обработку реактивом Фолина-Чеоколте ведут при рН 9,8-10,2,