Штамм клеток рабдомиосаркомы крыс ра-22, используемый для выявления особенностей опухолей, устойчивых к лечению гипертермией

Номер патента: 1751201

Авторы: Федорова, Вахтин, Трусова, Каминская, Гужова

Скачать ZIP архив.

Текст

(51)5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР ТЕНИЯ ПИСАНИЕ ИЗОБРВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(21) 4845902/13 ., лекции (78 циклов отбора) на устойчивость к (22) 07.06,90 термэльным воздействиям клеток штамма (46) 30,07.92, Бюл, Ь 28рабдомиосаркомы РА, полученного на (71) Институт цитологии АН СССР . основе штамма рабдомиосаркомы аффини- (72) Е,В,Федорова, В;Д.Трусова, Ю,Б.Вах- тетной РА, Штамм пассируетсянэ белых тин, Е.В.Камийская и И,В,Гужовабеспородных крысах путем внутривеййого (56) Степаньян Л,И., Вахтий Ю.В. Цитоло- введения суспензии одиночных клеток чегия, 1980, т, 22, М 2, с, 198 - 204 " . : рез каждые 20 дней. Штамм обладает . (54) ШТАММ КЛЕТОК РАБДОМИОСАРКО- высокой термоустойчивостью и МЫ КРЫС РА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ радиоустойчивостью, является удобной мо- ВЫЯВЛЕНИЯ ОСОБЕНЙОСТЕЙ ОПУХО- . делью для иэученйя процесса метастаэиро- ЛЕЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ЛЕЧЕНИЮ ГИПЕР- вания и испытания химиотерапевтических ТЕРМИЕЙ . -. препаратов для опухолей с повышенной (57) Использование: медицина, эксперимен-термо- и радиоустойчивостью; не чувствитальная онкология, Сущность изобретения: тельных к лечению гйпертермией и радиотеполучен в процессе многоступенчатой се-рапией, 2 ил,Изобретение относится к медицине и может быть использовано в экспериментальной онкологии для изучения процессов метастазирования терморезистентныхопухолей, а также для скрининга химиотерапевтических препаратов, подавляющих рост и метастазирование опухолей человека, ус-. . тойчивых к термотерапии.Известны штаммы опухолевых клеток мышей, характеризующиеся высокой степенью злокачественности и оргэно 1"ропным метастазированием: меланома В 16 и ее субштаммы, КСМЛ (штамм кэрциономы, метастазирующей в легкйе), ВМР (штамм высокометастэзирующего рака) и его субштаммы, ЛМТ (лимфогенно метастазйрую- щая тератокарционома), Однако частота метастазирования этих штаммов и-орТайотропность метэстазирования низки, частота метастазирования в другие органы более 15%, не известен штамм клеток, полученный на основе опухоли скелетных мышц(рабдомиосаркомы), штаммы получены не в результате длительйбй селекцйи, а лишь по-. сле 10-15 циклов отбора, характеризуются низкой колониеобразующей способностью и не обладают устойчивостью к термальным воздействиям.Наиболее близким к изобретению является штамм рабдомиосаркомы РАкрыс, полученный в Институте цитологии АН СССР путем многоступенчатого отбора на аффинитет к легочной ткани, Штамм характеризуется высоким метэстатическим потенциалом, более высокой по"сравнению с аналогами; колониеобразующей способностью (КОЕ = 0,013+0,006) и аффинитетом к легочной ткани (метастазы в другие органы не обнаружены), околотетраплоидным содержанием ДН К (ДИ = 1,97-2;04),Однако клетки штамма РАчувствительны к термальному воздействию 43, 44 и 45 С (Д 0 = 1,6 Гр) и недостаточно высокой колониеобразующей способностью.1751201, Целью изобретения является получение штамма рабдомиосаркомы крыс с наследственно повышенной термоустойчивостью клеток,Данный штамм РА.-22 получен в процессе многоступенчатой селекции (78 циклов отбора) на устойчивость к термальным воздействиям на основе штамма клеток рабдомиосаркомы РА, который получен в процессе селекции (200 циклов отбора) штамма РА.Селекцию штамма РАпроводили в условияхи чЬо при помощи внутривенных перевивок суспенэий одиночных опухолевых клеток, подвергавшихся термальному воздействию ин витра, белым беспоРодным крысам через каждые 20 дней. Суспензии одиночных опухолевых клеток получали из опухолевой ткани, взятой от 20-30 легочных метастазов, с использованием ростовой среды Игла. Нагревание суспензии проводили на водяной бане в термостате (точность нагрева +0,1 С), после нагрева клетки выдерживали 1 ч при комнатной температуре и вводили внутривенно животным, Доза вводимых опухолевых клеток - 200000 клеток на одно животное, Штамм хранится в Банке перевивных штаммов ВОНЦ АМН СССР, регистрационный М 13-9-3,Особенности культивирования штамма в условиях и чего.Штамм культивировали на ростовой среде Игла с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 2 мМ глутамина, 200 ед/мл пенициллина и 0,0004 г/мл стрептомицина, Культивйрование проводили при 37" С втерметических флаконах в термостате без подачи СО 2. Кратность рассева 1:3 йри пересеве через .72 ч, Посевная доза клеток - 200000 на мл. Криоконсервацию проводили в сыворотке эмбрионов коровы с добавлением 107 ь диметилсульфоксида при концентрации 1 х 10 клеток/мл. Жизнеспособность клеток после размораживания 85- 90%Ростовые характеристики штамма.Прививаемость животным при внутри- венных иньекриях 10000 клеток/жйвотное 100 ф, при подкожном введении суспензии опухолевых клеток в дозе 50000 клеток/животное 100, аффинитет к легочной ткани (экспериментальные метастазы формируются только в легких) 100 , колониеобразующая способность (КОЕ) 0,164.0,008,Морфологические характеристики штамма.Штамм представляет собой низкодифференцированную веретеноклеточную рэбдомиосаркому, Основные клеточные элементы веретеновидные (12 - 25 мкм) и округлые 9 - 15 мкм клетки. Штамм характеризуется околотетраплоидным содержаниемДНК (диплоидный индекс 1,86 - 1,91), Карио 5 логически штамм характеризуется 21 паройхромосом, большое число мета- и субметацентриков.Особенностью штамма является высокая термоустойчивость клеток, Значения Д 0,10 вычисленные по кривым выживаемости клеток после нагрева, равны при термальнойобработке 43 С 9,8 мин, при термальнойобработке 44 С 12,5 мин, при термэльнойобработке 45 С 13,5 мин.15 Особенностью штамма также являетсявысокая радиоустойчивость клеток. Значение До, определенное по кривой выживаемости клеток после их облучения вдиапазоне доз 1-10 Гр, равно 2,4 Гр.20 П р и м е р 1. Для изучения динамикиутраты термоустойчивыми опухолевымиклетками способности метастазировать после их нагревания при 45 С в течение 10, 20и 30 мин суспензию одиночных опухолевых25 клеток (концентрация клеток 1 млн/мл) всреде Игла помещали на водяную баню втермостат (точность нагрева +0,1 С) при45 С нэ 10, 20 и 30 мин, после нагрева клетки выдерживали 1 ч при комнатной темпе 30 рэтуре и вводили внутривенно каждуюпробу 10 белым беспородным крысам (доза введения - 200000 клеток на животное),Через 21 день животных забивали и проводили подсчет экспериментальных метэстэ 35 зов в легочной ткани. На основанииполученных результатов строили кривые выживаемости клеток (фиг, 1),Полученная кривая доза-эфФект показывает, что в пределах термальных воздей 40 ствий 1 - 5 мин подвергнутые нагреваниюопухолевые клетки репарируют термальныеповреждения. Эффективное подавлениеспособности опухолевых клеток к метастазированию начинается с 5 мин термального45 воздействия, Нарастание утраты способности формировать экспериментальные метастазы характеризуется в данном примерезначением Д 0 (Д 0 = 13,5 мин). Таким образом, штамм позволяет выявить динамику ут 50 раты термоустойчивыми опухолевымиклетками способности формировать экспериментальные метастазы при определенном режиме нагревания и прогнозировать55 результаты термального воздействия различной продолжительности,П р и м е р 2. Для изучения комбинированного действия нагревания и различныхрежимов облучения нэ термоустойчивыеопухолевые клетки суспенэию одиночныхопухолевых клеток РА(концентрацияклеток - .1 млн/мл) в среде Игла помещали на водяную баню в термостат, точность нагрева 0,1 ОС (при 44 С на 20 мин), после нагрева клетки выдерживали 5 - 10 мин при комнатной температуре и облучали в диапазоне доз 1-10 Гр на рентгеновском аппарате РУФ, фильтр 1,0 Си, 257 р/мин, вводили внутривенно каждую пробу 10 белым беспородным крысам (доза введения 10000 - 400000 клеток на крысу), Через 21 день животных забивали и проводили подсчет экспериментальных метастазов в ле. гочной ткани; На основании полученных результатов строили кривую выживаемости клеток (фиг, 2). Полученная кривая доза-эффект показывает, что эффективное подавление их нагревания при 44 С в течение 20 мин. и последующего облучения начинается с дозы облучения 2 Гр и нарастает по мере увеличения дозы облучения (2 - 10 Гр), Полученная кривая доза-эффект позволяет прогнозировать результаты комбинированного воздействия разных режимов облучения и . нагревания для клеток термоустойчивцх опухолей,П р и м е р 3. Для скрининга химиотерапевтических препаратов, подавляющих рост и метастазирование опухолей челове. ка, устойчивых к термотерапии, суспейзию одиночных опухолевых клеток термоустойчивого штамма РАконцентрация клеток 100000/мл в среде Игла вводили внутривенно каждую пробу белым беспородным крысам (0,2 мл на животное): 10 животных - на каждый вариант опыта и 10 животных - на контроль. Через разные сроки после внутривенной перевивки (5, 10 и 14 сут) внутри. брюшинно вводили сарколизин в дозах 10, 20 и 30 мг/кг и через 21 сут после внутри- венной перевивки животных контрольной и опытной групп забивали, извлекали легкие, вцлущивали клоны, подсчитывали их количество и взвешивали на торзионных весах, и затем определяли количество колониеобразующих единиц (КОЕ) и торможение роста опухоли по общепринятым методикам,Сарколизин, введенный вуказанныхдозах, оказывает заметное влияние на динамику изменения массы клонов и на количество клонов в легких, однако терапевтический эффект в значительной степени зависит от дозы препарата и режима еговведения. Процент торможения роста опухоли в опыте при использовании показателя"количество клонов на легкое" в .от 16,2 до 96,3, при использовании показателя "масса опухолевой ткани на одно легкое" от 51,5 до 96,2 ф. Наблюдающиеся в опытах изменения клонов по количеству и массе позвогетерогенности популяции клеток термоустойчивых опухолей по чувствительности к сарколизину и определить, что значительную часть популяции -составляют клоны, способные репопулировать после терапев 15 тического воздействия, Таким образом, использов.ание термоустойчивого штамма РАпозволяет более дифференцированно изучать закономерности влияния химиотерапевтических препаратов на опухоли, ус 20 тойчивые к термотерапии. выявлять особенности и динамику этих воздействий,Таким образом, предлагаемый штамм, как было уСтановлено в экспериментах, по 25 ставленных с 10 по 60 пассаж селекции обладает более высокой колониеобразующей способностью (КОЕ = 0,16+0.08) по сравнению с прототипом - термочувствительным штаммом (КОЕ = 0,13+0,006). Дан 30 ный штамм обладает почти в 3 раза более высокой термоустойчивостью (До = 13,5 мин), чем прототип - термочувствительный штамм (До = 4,1 мин). Радиоустойчивость заявляемого штамма (До = 2,4 Гр) примерно в 1,5 раза больше. чем радиоустойчивость штамма - прототипа (До = 1,6 Гр).Из этого следует, что предлагаемый штамм является удобной моделью для изучения процесса метастазирования и испытания химиотерапевтических препаратов для опухолей с повышенной термоустойчивостью и радиоустойчивостью, и поэтому не чувствительных к лечению гипертермией и радиотерапией.формула изобретенияШтамм культивируемых клеток рабдомиосаркомц крыс РАМ 13-9-3 (Банк опухолевых штаммов ВОНЦ АМН СССР), используемый для выявления особенностей опухолей, устойчивых к лечению гипертермией,10 ляют выявить высокую степень1751201 ФчкцияВыавжИхклеток10 ракция ыживши ваяет 10 остэвитель Е, Федороваехред М.Моргентал Корректор И. Муск еда выдка Заказ 2664 ПодписноеВНИИПИ Госуд итета по изобретениям и открытиямква, Ж, Раушская наб., 4/5 Тираж арственного ком 113035, Мос

Смотреть

Заявка

4845902, 07.06.1990

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АН СССР

ФЕДОРОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА, ТРУСОВА ВАЛЕНТИНА ДМИТРИЕВНА, ВАХТИН ЮРИЙ БОРИСОВИЧ, КАМИНСКАЯ ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА, ГУЖОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

МПК / Метки

МПК: C12N 5/00

Метки: гипертермией, штамм, клеток, лечению, выявления, опухолей, устойчивых, рабдомиосаркомы, ра-22, особенностей, крыс, используемый

Опубликовано: 30.07.1992

Код ссылки

<a href="http://patents.su/4-1751201-shtamm-kletok-rabdomiosarkomy-krys-ra-22-ispolzuemyjj-dlya-vyyavleniya-osobennostejj-opukholejj-ustojjchivykh-k-lecheniyu-gipertermiejj.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Штамм клеток рабдомиосаркомы крыс ра-22, используемый для выявления особенностей опухолей, устойчивых к лечению гипертермией</a>

Похожие патенты