Способ получения перманентно растущих животных и человеческих клеток

ОЮЗ в 1 АЗ БЛИН 4 С О 1 И 33 4 ИЕ ИЗОБРЕТЕН П АТЕНТ клеток в присутствии объединяющихвеществ (полиэтиленгликоля или вируса Бепйа 1). Получают Фрагмент трансФормированных клеток, Прорывают стенку клетки (разрушают) путем лиэиса вглицерине с внесением н несодержащийглицерин буферный раствор (при этомлопаются клеточные мембраны) илимеханически. Центрифугированием отделяют фракции ядер от фракций цитоплазмы и используют все Фракции.Фракции цитоплаэмы обогащают митохондриями лимфатических или этителиальных опухолевых клеток. Приготавливают кариопласты и цитопласты, обрабатывая клетки цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные ядра (кариопласты) иокруженная мембраной, лишенная ядрацитоплазма (цитопласты) пригодны дляслияния. Фрагменты клеток в свежем 34 Е) вйнрихАльберт (А оГ 1 ивей у о 1 рпедеГх 25 ф, 495-497) НИЯ ПЕРИАНЕПТНО,И ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ соб ащиваелеток испол состоя после их приго обеспечивая их зированном сос 5, табл. тов,способае норохранениеянин, 2 з,лиофили ф-лы, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ 21) 3594155/28-1422) 03.05.8331) Р 3216650.8 р Р 324566532) 04.05.82 р 09. 12.82(56) Соцй 1 пиопв сц 1 Сосе 11 в весгег.1 щ апсдЬпед вресГсу, Яайцге1975,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕРАСТУЦИХ аВОТНЫХКЛЕТ 01:(57) Изобретение касается споприготовления перманентно вырмых животных и человеческих ки применения полученных клетопроизводства клеточных продухЦель изобретения - упрощениеДля этого осуществляют слиянимальных животных или человече эуют непосредственновления или позднее, 17424744П р и м е р 5, Слияние НР 1 П, с Фрагментами из линии человеческой плаэмацитомы НБ БЩ,ТАМ,НБ БП.ТА относится к американской коллекции типов культур (ЛТСС) пад кодовым номером СК 1,-1484 в качестве криопредохраняющегася клеточного материала и аттаивается па АТСС-предписанию и культивируется.НРВ 1., как в примере 4, приготовляется адпнаковыми донорами и "рецммуцизируется п ч 1 га с НВ Слияние; 4 х 10 1 Б БН 1.ТАМ клеток фрагментируют посредством лиэиса с глицерином, Пузырьковые фракции мембранной цитаплазмы седиментируют при 5500 д (40 миц) и затем наносят смесь примерна 4 х 10 НБ Б 1 П.ТА ядер и 4 х 10 НРВ 1,(В) . ПЭГ - слияние осуществляется по примеру 4, Посев продукта слияния осуществляется на 12 24-ных Созаг-ТйрГе 1 п в К РМ 1 1640 + 20 РКБ + пируват + инсулин (ИОЧО 2 ед/мл) + 1 Е не основных аминокислот (ВИ) + 12 метацелия 1500 беэ добавки НАТ,На 14-й день после слияния: рост больших, неслипшихся лимфоидных колоний клеток.П р и м е р 6, Обессмертивание человеческих Т-лимфоцитав.Т-лимфоциты выделяют с помощью стандартного способа (придание формы розетки с помощью овечьих эритроцитов, цецтрифугировацие с градиентами по Р 1 со 11) из общей фракции лимфоцитав и тстчас или после 3-дцевцого культивирования обрабатывают ЕЬг 1 дсЬ асцитцые клетки (АТСС; СС 1. 77) культивируют в ДИЕИ с 1 О.-най лошадиной сывороткой и ани служат в качестве донора трансформирующих фрагментов, ФрагментациюЕА 2 осуществляют с помсщью глицеринового лизиса. Гадержащую преоблддающе материал ядер фракцию отделяютпутем центрифугиравания и отбрасывают, Для трансформации используютобогащенную митохацдриями цитаплазматическую мембрана-пузырьковую Фракцию.(СИ 7) 5 х 10 Т-лимфацитов, "нагружают" избытком РНА-лектина (Вз.йсо),смешивают с СЮ-Фракцией из ЕА 2 и инкубируют 20 мин при комнатной температуре, Смес.ь седиментируют путемцентрифугирования, остаточную нддосадочную жидкость удаляют и заменя 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ют 1 мл 507.-ного раствора ПЭГ. После мицугцага воздействия ПЭГ - рдствор разбавляют путем добавки К 1 И 1-1640- питательной среды и путем цецтрифугиравдция отделяют ат клеток. Клетки вносят в Р РМ 1-среду с 20 Л пладнай (эародьшевой) телячьей сыворотки (ГКБ, ВИ), распределяют ца 12 "пятен" для культивирования па 1 мл и кульотивцруют при 37 С в содержащей 57. СО -атмосфере, Охардктериэовывание клеток осуществляют руководствуясь паверхностцыми признаками посредством овечьих эритрацитов (Е) - розетиравацие и посредством иммунофлуоресценции при применении обоих специфических для Т-клеток антител ОКТи Флуоресцентно маркированного античеловеческого иммуцоглобулина (1 В, Фирма Дако) для доказательства типичного для В-клеток мембранного 1 ц.В течение первых 14 дн большая часть клеток в культурах погибаетНд 21-й день в клеточных остатках колоний проявляются от маленьких до средних размеров клетки, которые непрерывно размножаются. Рост колоний обнаружен во всех 12 ТйрГе 1 п-"пятнах", а именна вплоть до 50 колоний на пятно, На 30-й день колонии переводят в более крупные сосуды для культивирования и размножают далее. Клетки анализируют, руководствуясь их поверхностной маркировкой, и получают следующие результаты, 7:Е-розетки - положительные )95ОКТ- положительные 904-11 - положительные )901 ц з - положительный 5,Фрагменты, которые могут получаться из ЕЛ 2 (пермацентная линия клеток мышей) с помощью глицериновагс лизиса, после ПЭГ-слияния с иэалироваццыми Т-лимфоцитами производят перманентна растущие в культуре клетки, которые ца основании их поверхностной характеристики четко идентифицируются как Т-лимфациты.П р и м е р 7. Придание бессмертности человеческим клеткам эндотелия,Все сосуды для культивирования перед посевом клеток покрывают жела- тиной, Питательная среда состоит из (1:1) смеси К РИ 1-1640 и среды 199 (ВИ) с 20 Х РКБ. 1 елавеческие клетки эндателия получают посредством раствора каллагенаэы (СЬсо) иэ вен20 Во всех 4-х частичных культурахподвергнутые сгияцию с С 1 Я-клеткимелацомы на 28-й день вырастают вколонии типично пигментированныхклеток в форме полуслипшихся клеточных груд, которые непрерывно увеличиваются. В контрольной культурепсевдослившиеся клетки не дают никакого размножения клеток, напротив,клетки на 8-й день показывают увеличивающееся гранулировацие и на22-й день в культуре наблюдают толь.ко обломки клеток,Человеческие мелацомные клетки из криопредохранеццой метастазной ткани путем С 1 Я-слияния могут трансформироваться в способные размножаться и культивироваться п чдГго клетки Псевдослившиеся мелацомцые клетки равного происхождения, напротив, по 19 14247свежих пуповин и перед трансформацией размножаются в течение 14 дцблагодаря предрасположению первичнойкультуры, Для трансформации растущие5как слипшиеся клетки эцдотелия отделяют посредством растворм трипсина сЕПТА (ВИ) и в суспензии, как описанов примере 6, подвергаются слияниюс СИ 7"Фракцией из ЕА 2, Таким образомобработанные клетки высевают в сосуддля культивирования емкостью 75 смпри плотности клеток 5 х 10 э на одинсосуд и культивируют в СО -инкубаторе, Для контроля при необходимостиаликвотную часть клеток эндотелия изпервичных культур без Фракции С 1 Яобрабатывают ПЭГ-раствором (кажущеесяслияние) и повторно культивируют,Как только клетки на дне сосуда длякультивирования образуют сплошныеклеточные газоны , то их отделяют спомощью трипсин-ЕНОТА - раствора и всоотношении 1:3 переносят в свежийсосуд для культивирования (-пассаж). 25Подвергнутые с помощью СИ 7-фракциислиянию клетки эндотелия после посева прилипают с эффективностью 20-307.и вырастают в течение 2-3 дн досливающихся клеточных "газонов", Кажущиеся слившимися клетки прикрепляются примерно с одинаковой эффективностью, однако они едва размножаются,и в течение 21 дн полностью погибают,не образуя сливающихся клеточных"газонов . Совершенно необработанныец35клетки эндотелия размножаются до максимальной величины при 3-м пассаже,затем рост останавливается, их освобождают при "скатывании" со днасосуда для культивирования и подвергают лизису, В 8 различных сосудах склетками эндотелия иэ в целом 18различных пуповин вырастают без всяких проблем СИ 7-обработанные клетки.в течение 10-го пассажа. Трансформированные клетки эндотелия без потерьв жизнеспособности и способности кделению могут отверждаться в жидкомазоте,50Человеческие пуповинные клеткизндотелия без трансформирующей манипуляции согласно изобретению могуткультивироваться в течение не более3-х пассажей, Путем слияния обогащен 55ной митохондриями СЮ-фракции иэ асцитных клеток Эрлиха свойства культуры клеток эндотелия изменяютсятак, что они без всякой проблемы 44размножаются свыше критического 3-гопассажа (найдено, что в 23-ем пассажеклетки находятся без "явлений усталости")П р и м е р 8. Придание бессмертности человеческим меланомным клеткам.Содержащую клетки меланомы ткань получают путем хирургического иссекация метастаз подвздошцых лимфатических узлов, разрезают в стерильных условиях на маленькие кубики и хранят вплоть до слияния в сжиженцом азоте. СМ 7-Фракции из ЕА 2 готовят, как в примере 6.Перед слиянием содержащий меланомные клетки материал оттаивают и посредством обработки трипсином готовят суспензию из отдельных клеток, фракцию больших, пигмецтированных в красно-коричневый цвет меланомных клеток путем центрифугировация с градиентами по Рдсо 11 освобождают от сопровождающих лимфоцитов и как в примере 6 подвергают слиянию с СИ 7-фракцией при воэдействии ПЭГ (примерно 4 х 10 мела% номных клеток с СИ 7 из примерно 1 х 106 ЕА 2). Для контролирования слияния служат 4 х 10 меланомных клеток, которые обрабатываются без СМЧ с помощью ПЭГ. Клетки после слияния высе 5вают при их плотности 1 х 10 на ТирЕе 1 (" пятно" ) в Р РМ 1 1640 + 203оРК 5 и культивируют при 37 С в содержащей 5 Е СО-атмосфере,21 4 гибают даже при идентичных условияхкультивирования. формула и э о б р е т е н и я Составитель Е. КалмаковаТехред М,Дидык Корректор Л. Патай Редактор М. Келемеш Заказ 4702/59 Тираж 847 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 1. Способ получения перманентно растущих животных и человеческих клеток путем слияния нормальных животных или человеческих клеток в присутствии полиэтиленгликоля или вируса, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, анормальные животные или человеческие клетки подвергают слиянию только с кариопластамн,.цитопластами, ядерной фракцией и фракцией цитоплазмы,24744 22обогащенной митохондриями лимфатических или эпителиальных опухолевых клеток.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с, я тем, что перед слиянием кариопласты и цитопласты обрабатывают цитохалаэином,3. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что ядерную Фракцию и фракцию цитоплаэмы получают путем механического разрушения или лизиса в глицерине.Приоритет по пунктамф04.05.82 по пп. 1-3;09.12.82 по п. 1.Изобретение относится к способу приготовления перманентно выращиваемых животных и человеческих клеток и к применению полученных линий клеток для получения клеточньм продуктов.Цель изобретения - упрощение способа.Способ осуществляют следующим образом.0Слияние осуществляют известными методами в присутствии объединяющих веществ - предпочтительно в присутствии полиэтиленгликоля или вируса (Бепдад). Получают фрагменты трансформированных клеток.Прорывают стенку клетки путем лизиса или механически. Затем путем центрифугирования отделяют фракции ядер от Фракций цитоплазмы и исполь О зуют все Фракции, Осуществляют лиэис путем набухания клеток в глицерине и последующего внесения в несодержащий глицерин буферный раствор, Это приводит к тойу, что лопаются клеточ ные мембраны, Приготавливают кариопласты и цитопласты путем обработки клеток цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами кле" точные ядра (кариопласты) и окружен О ная мембраной, лишенная ядра цитоплаз. ма (цитопласты) пригодны для слияния.Фрагменты клеток в свежем состоя 1 нии используют непосредственно после их приготовления или позднее для осуществления слияния, причем в последнем случае обеспечивают сохранение в лиофилизированном состоянии.Применяют фракции клеток, которые могут быть неполностью чистыми, одна ко не должны содержать никаких интактных, способных размножаться клеток.Для образования гибрида не исполь" эуют в качестве вырожденной клетки НАТ-чувствительную клетку, Перманентно растущие линии клеток, которые не обладают НАТ-чувствительностьюэ используют для приготовления фрагментов для слияния,При описании конкретных примеров используются следующие сокращения и товарные названия:АК антитело;1 К иммуноглобулин;Н- или551.-цепь - "тяжелая" или "легкая"протеиновая цепь 1 ямолекул;2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан; пристан НАТ-селекционная среда -ТКНСРКТ ЕВЧМц 1 Л СВ ДИСО ДИЕИ Рдсо 11 ПЭГ РВБ РОРАВТБ ЕВББ КРМ 1 "1 640 -Трис РВ 1. ИИС Р-ЬТБНРА СРА 1 РА Г 1 етоцель 1500 метилцеллюлозаС 1 Ч 5 Г 1 ТС-СочаярЬегея 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пузырек мембраннойцитоплаэмы (ццтоплдзма - мембрана - пузырек); флуоресциниэотиоциднатв шаровидной форме(СОЧА 1 Е 1 Т ТЕСН 1 САЬАпп АгЬог, Иич, С 11 А);ЕАЕ асцитцые клетки Эрлиха(АТСС; СС 1., 77) .Пример 1.А. Получение кариопластов и цитопластов из мьшьиных миеломных клетоклинии РЗ Х 63 А 8 8.653 АТС о-Ск1. 1580.А,1. Цитохалаэин В (СВ, А 1 дг 1 с 1 сВдосЬеппса 1 я, И 11 ыаа 1 ее, С 1 А) растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСОИеге 1; 2 мг/мл) и хранят в качествеоосновного раствора при 4 С,Гдсо 11-400 (РЬагшдсьа; полимеризованцая сахароза) растворяют вбидистиллированцой воде (1 г/мл),автоклавируют и хранят в виде 50%-ногоосновного раствора при -20 С.Однократной и двойной концентрацииэссенциальную минимальную средуРп 1 Ьессо (ДИЕИ), эмбриональную телячью сыворотку (ГКЯ), Ь-глютамин(200 ммоль/л), стрептомицин-пенициллин ВоеЬгьп 8 ег МаппЬеип целлюлоэоцитратцых трубочек стерилизуют путемУф-облучения.Линия миеломцой клетки Ав 8.653АТСС СР. Ь - 1580 : 123, 1548-1550(1979). Она азагвиниц-резистентна,НАТ-чувствительна ц не синтезируетни Н-, ни Ь-цепей, Она хранитсяв ДИЕИ + 157 ГКБ + глютамин + пенициллин-стрептомицин + пируват (-ДМЕ 11- ополная среда) при 37 С в атмосферес 7% СО,А,2, Методы энуклеации: 8 х.10 А,8.653 клеток центрифугируют в течение5 мин при 10 З об/мин и повторно суспендируют в 12 мл 1,57-ного Г 1 со 11 ДИЕИ-СВ-ДИСО-рдствора до тех пор,пока не будет получена лишенная комков клеток суспензия. По 3 мл суспензии клеток наносят ца предварительно (за 4 и 12 ч) препарированныеГьсо 11-градиенты и покрывают 2 мл несодержащего Г 1 со 11 ДМЕМ-СВ-ДИСО-раствора. Пробирки с градиецтамц центрифугируют в ультрдцецтрифуге в течение60 миц при 25 000 об/мин (31 С). По окоцчдццц цсцтцн,у процдцпя сн рху раздельно собирают помощью ццъскцлонцого шприца с длинной кдцюлей мдкроскопически вцьцмые фракции ( полосы ), каждую рдэбдцляют питательной средой (Д 1 Е беэ добавок), седлментируют путем цецтрифугировднил и снова суспецлируют в свежем ДЕ 1,Получают следующие 4 фракции: а) клетки ПеЬп 1 я (цд грдцице между О и 12,5% Г 1 со 11); б) лишенные ядра цитоилдсты в области 15-16% Г 1 со 11; в) ядра беэ различимого ободка из плазмы и примерно 27. лишенных ядра "клеток" ца границе между 17 и 25% Г 1 со 11; г) содержащие ядра, нцтактные по морфологцческим критериям клетки с хорошо различимым ободком из плазмы и немного ндер беэ ободка из плазмы в качестве седпментд на дне пробирок.Подсчет клеток показывает, что Ях 10 АБ 8.653 - клеток в б содержит 1,5 х 10 цитоплдстов, в в.664 х 10 кариопластов и в г) - 1, 1 х 10 предположительно интактцьгк Клеток.Б, Слияние клеток селезенки мыши с изолироваццымц кариопластами миеломы, цитопластами мцеломы и седиментными клетками миеломы из опыта А.Б,1, Способствующее слиянию средство, 20 г полиэтилецгликоля (ПЭГ 4000) расплавляют в автоклаве, охлажодают до 56 С и при этой температуресмешивают с 20 мл ДМЕ 1;НАТ - селекционная среда: ко всейсреде ДИЕИ добавляют аминоптерин(4 х 10 ), тимидин (1 х 10 ) и гипоксантиц (3, 1 х 10 ) .Сосуды для культивирования: кластер 24-ткацевой культуры и кластер96-ткацевой культуры фирмы Соягаг,Камбрцдж, Идсс., С 11 А,Б,2, Слияния. Препарированные вопыте А фракции б, в и г раздельносмешивают с клетками селезенки в соотношении 10:1 и седимецтируют путемцецтрифугирования. Надосадочную жидкость тщательно удаляют. К седиментудобавляют 0,8 мп 507-ного раствораПЭГ (при 37 С в течение 1 миц припостоянном мягком встряхивании) изатем 5 мл Д 1 Е (при комнатной температуре в течение 5 мин), После добавки следующих 20 мл ТБЕ клетки седиментируют, повторно суспецдируют всвежей ДИЕ 1-полной (полноценной) среде (5 мл) и размещают цд как,лые 1 О, 5 14покрытые "питающими клетками" 24-ыеСонтаг Тцрйе 1/Сонтаг = пятна",поры . Отдельные культуры кормятна каждый 1, 2, 3, 7, 10 и 13 йдень с помощью ДИЕИ-полной среды.Клетки питающего организма (макрофаги брюшной полости), За день дослияния умерщнляют инцухтньа мышей(Ва 1 Ь/с) путем вытяжки, В стерильныхусловиях в брюшную полость шприцомвводят 4-5 мп РВБ и спустя 1 минснова отсасывают. Вымытые клетки промывают ДИЕИ, суспендируют н полнойсреде до плотности клеток 2 х 10 в1 мп и порциями по 0,5 мл размещаютна 24-ых Сонтаг Тцр:е 1/Сонтаг-пятнахКлетки селезенки. У одной Ва 1 Ь/смьппи непосредственно перед слияниемв асептических условиях удаляют полностью селезенку и ее клетки суспендируют в ДИЕИ. Клеточные агрегаты икусочки ткани отфильтронынают черезмарлю,ЕЬ 18 А на иммуноглобулине мьппи.Пластинки для микротитра покрываютовечьими антителами на мышиный 18(18 С-Фракция; 10 мкг/мл, 0,9 Е-ного раствора ЛаС 1; 150 мкл раствора антителна Тцрйе 1 (пора, пятно). По 100 мклкультуральной надосадочной жидкостипипеткой вносят н покрытые пятна(ТцрГе 1) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре, После отсасываниянадосадочной жидкости и 2-кратнойпромывки Тцрйе 1 ("пор", "пятен") покрывают 100 мкл раствора конъюгатаРОД с антимьппиным 18 (такое же антитело, как ньппеуказанное, ковалентносвязанное с пероксидазой хрена) иинкубируют 1 ч при комнатной температуре, После 3-х кратной промынкина ТцрГе 1 пипеткой наносят 100 мклраствора субстрата (АВТБ) и фотометрически определяют появление окраски.24744 6 ток, эа исключением пятен 4 А, 4 В, 4 С, ЗС и ЗД на пластине 1, которые содержали продукт слияния (-Рцзгопаг) 5 седиментной фракции без НЛТ-среды. В этих пятнах уже спустя 5 дн после слияния распознают колонии, которые быстро увеличиваются, На 8-й день после слияния н эти пятна (ТцрГе 1) добавляют НАТ-среду: в течение 4 дн вследствие этого погибают все видимые колонии. На 27-й день после слияния прежде всего разъединяются, затем примерно на всех пятнах становятся видимыми колонии, которые состоят из крупных шарообразных, прозрачных, растущих не сросшихся клеток. На 65-й день после слияния, эа исключением 1-3 В, 11-1 А, 11-4 А, все "пятна заняты множественными колониями лимфоидных клеток. Исследование надосадочной культуральной жидкости на содержание мьппиного 1 я на этот день дает (см. табл, 1) от 25 положительных до сильно положительных значений в ЕЬ 1 БА во всех частичных культурах, за исключением вьппеуказанных, не содержащих колоний "пятен",Таблица 1 30 ЕЬ 15 А для доказательства мышиного иммуноглобулина н надосадочной жидкост культуры опыта Б (65-й день после слияния): (Тцрйе 1) "Пятнообразная пластина для культивирования 1 : без НАТ (исключения: 4 А, 4 В, 4 С, ЗС, ЗД: + НАТ 8-18 дни; 1 - продукт слияния цитопластов; 2 - продукт слияния карио пластов; 3 - продукт слияния седиментных клеток2 3 4 5 6 45664вергаюВа 1 Ь/по 1 мл е обнаруживают мамикроскопически ро копически ил имфоидных кл Б,З. Препарированные согласно опыту А цитопластные, кариопластные и седиментные фракции параллельно подт слиянию с клетками селезенкис-ьпши и размещают на каждые 10культуры, По 5 частичных культур кормят без (пластина 1) и по 5 с добавкий НАТ (пластина 11).Вплоть до 21-го дня после слияния ни в одной иэ пятнообразных пластин 576 792 З"Пятнообразная" пластина для кул ивирования 11: с НАТ (1-14 дни отицательная культура 1 (ДИЕИ-полная7 14 среда): 010; отрицательная купьтура 2 (ДАЛЕМ, без ЕКБ): 040; положительная культура 1 (мьппиная сыворотка 1 х 10-д):723; положительная культура 2 (мышиная сыворотка 1 х 10 ): ) 1500 2 3 4 5 6 А 008 В 267 56 Р 84 3 идно иэ табл. 1, слияние тон с клетками мьппиной сел водит к 1 п ч 1 Гго размножаю деляющим иммуноглобулин Хотя только малая часть ци к кариоп нки щимся,клеткам топлаэмы злокачественного партнера вводится в гибрид, он не приводит к возможной экстинкции признака перманентного роста . При этом полученные с кариопластами гибридные клетки синтезируются и ныделяют мышинь иммуноглобулин в "гибридомных" количествах. Отсутстние доли цитоплазмы А 8 8.653 не нарушает соответственно этой продукционной и секреционной способности гибридов кариопласта с клеткой селезенки. Кроме того, из слияния цитопластон с клетками селезенки также следуют клоны клеток, которые 1 п ч 1 гго пролиферируют и выделяют антитела.П р и м е р 2. Фрагментация клеток посредством лизиса глицерином и слияние с человеческими лимфоцитами ови.Балансирующий солевой р г 1 е (ЕВББ) питательная астнорЕа среда КРИ 1 1640, эмбриональная телячья сыворотка (РКБ) ВоеЬг 1 щег Мап"е 1 ш 8-азагуанин (8-А 8) Бегча ейдельберг), Агар (бакто-агар 16 14 дГсо - фирма Гедингер КГ, Итутгарт)Человеческая плаэмоцитомная линия НБ БНЬТАИ АТСС СР. Ьв виде криопредохраненного клеточного материоттаивается по предписанию АТССультивируетсяи24744 8 ир 5 етки нагргаится1 О 11 ция НБ фрагметажаются глицелизису путемтрис-НС 1-буфмембранных ифугирования), этииментиря при 50 яю от трим це и 200 корен пузыр своеи ются пут ОО е (40 ие, Примерно человеческим руют в К РМ 1 и подвергают Г, как в при ент мембраниз 1 х 10 НБ успензией 1 х 29 НБ-К ядер ссуспендинии 1:1ством Плимфоцитами 1640 в соотношеслиянию посредмере 1, и. Б 2,ных пузырьков -К 1 клеток пок человеческих7 и ример ынают 8 х 10 НБ Бц 1 г.ап - клегок в 100 млК РМ 1 1640 - полной среды, котораясодержит 20 М Я-А культивируют48 ч. Пережившие клетки помешают в 510 мл Р 111 1640-полной среды без8-А 8 и выращивают 1 О дн. Клеткизатем высевают на пластины из мягкого агара, которые были приготовленыс помощью К РМ 1 1640-полной среды +2011 8-Ан, (примерно 500 клетокна чашку Петри), и помещают вСО -инкубатор. Спустя 9 дн стерильноготделяют изолированно выросшие колонии от поверхности агара и размножают н -Р. РМ 1 1640-полной среде + 8-Ад.Клон (обозначается в нде НББОЬТА 1-8 А-К 1), который вырос приудвоенном времени (примерно 20 ч) 20 применяется для следующего опыта.НБ-К 1 клетки НАТ-чувствительны:клетки, которые культивировались вНАТ-среде с плотностью (1-5)х 10 на51 мл (К РМ 1-1640-полная среда с 25 0,1 ммоль гипоксантина, 400 р 11 аминоптерина, 3 1 ц 11 тимидина), не размножаются и н течение 7 дн полностьюпогибаютЧеловеческие лимфоциты (из периЗ 0 ферической крови: РВЬ): 300 млвенозной крови стерильно соб аютв гепариновый раствор (2 ед/мл кровии стандартными методами вьделяютфракцию моноядерных клеток (ЮС: 35лимфоциты, моноциты), Зх 0 ЖСсуспендируют в 100 мл К РМ 1 1640 хх 107. РКБ и для отделения моноцитовинкубируют 24 ч в сосуде для культивирования при 37 С в атмосфере, со держащей 52 СО.44 10клеток, которые непрерывно увеличиваются по размеру,Продуцирование человеческого иммуноглобулина. На 21-й день послеслияния надосадочную жидкость культуры (на 19-й день произведена полнаязамена среды) исследовали на содержание человеческого иммуноглобулина.Результаты представлены в табл,2 а и б. Т а б л и ц а 2 а. 1 2 3 4 5 6А 029 147 286 147 228 270 Э 120 1148 024 096 023 15 1 1 2 3 4 5 6 3 В 103 264 229 253 271 260 С 045 343 370 128 150 126 11 + ПЛТ 4 А 135 290 107 279 530 674 11 - НАТ А 381 235 489 514 608 217 В 348 239 214 158 367 163 С 185 275 235 234 322 316 Р 219 202 292 283 220 052 9 14247лимфоцитов и подвергают слиянию посредством ПЭГ,В контрольной смеси примерно2 х 10 НБ-К 1 ядер поглощаются (раст"воряются) в К РИ 1 1640-полной среде(без НАТ) и культивируются в 4-х,24-х Соегаг-Тцр 1 е 1 п (Соесаг-"пятен" )в СО-инкубаторе.Все слившиеся клетки (Рцегопае)и контрольные культуры культивируютсяна макрофагах брюшной полости мыши,как в примере 1, в качестве клетокпитающего организма.Доказательство человеческого 1 вв надосадочной жидкости культуры:микротитр-Е 1 геа, как в примере 1,п. Б.2, Для покрытия применяют иммуноадсорбционно очищенное овечье антитело на человеческий 18, Такая жеАК-препарация используется для приготовления конъюгата РОП с человеческиманти. Овечья АК реагирует со всемиклассами человеческих 1 я и не проявляет никакой перекрестной реакционноспособности с бычьим или мьппиным 1 я.Фрагментация благодаря лиэисус помощью глицерин-трис-НС 1. Обработ 1 - НАТка разлагает НБ-К 1-клетки на содержа 30щую ядра фракцию, которая седиментируется при 200 , и на лишеннуюядер цитоплазмамембранную пузырьковую А 660 233 175 270 410фракцию, которая седиментируется при5000 8. Под микроскопом не видны нив одной из обеих фракций интактныеНЯ-К 1-клетки, Ядра окружены болееили мее нерегулярно ограниченными р 171 173обрывками цитоплазмы. Подсчет даетвыход ядер 852. Пузырьковая фракция40содержит наряду с небольшим количеством осколков (остатков) в большомколичестве пузырьки величиной 0,5- 1 2 3 4 5 6-2 рМ без распознаваемых составныхчастей ядер.Культивирование 2 х 10 ядер в7К РМ 1-полной среде (без НАТ) не В 116 500 469 315 315 627приводит на протяжении 12 нед ни кС 120 050 068 159 226 145какому росту НБ-К 1-клеток.КУльтивирование слившихся клеток. П 191 078 686 110 242 550Слившиеся клетки (Гцеопаге) ядрапимфоциты и цитоплазма - пузырькипимфоциты размешиваются на 96, соот 1ветственно 1024-х СоеСаг ТцрГе 1 п(СоеСаг-"пятен" ) и культивируютсякаждый наполовину с или беэ добавкиНАТ и К РМ 1-полной среде на макрофагах мышей. С 2-й недели после слияния появляются колонии лимфоидных11 1424744Таблица 2 бСлияние цитопластов, 21-й день послеэслияния, где 1 - ядерная контрольнаяРкультура; 2- с НАТ; Э - без НАТ.э Если устанавливают величиныкстинкции 0-99 как от от -ицательных до сомнительных 5качения 100 - 200 - как положительные , значения более 200 -как сильно положительные , тодля полчченных путем слиянияядер культур получается рас О пределение , которое представлено в табл. Э,аблица Е 15 А на человеческо ноглобулин Отрицательно Положитель ьно положильно С НАТ (п=49) ((37 23) э НАТ (п=48) (,". 25) только 402 сильно положительно; бНАТ свьппе 703 сильно положительнтолько 47. 1 я - отрицательноП р и м е р Э. Слияние клетокселезенки иммунизированной мьппи снативными и фрагментированными клеками миеломы А 8,653.Человеческий стимулирующий ТЬутс1 еа гормон .(ЬТЯ 1) и его изолированная -цепь ф-ЬТБН) происходит изВоеЬгЫеег ИаппЬеш, комплектной инекомплектной добавки Ргецпй (СРА,1 РА) Рдйсо, метоцелий 1500 Р 1 и КАОи Р 1 ТС - сочазрЬегез чоп соча 1 епТесЬп. СО. Апп. АгЬог. Иичиган, США. Таким образом, слившиеся клетки (РозопаСе), которые приготовлены с помощью лизисных фракций, могут культивироваться без НАТ-селекции, Способ намного менее требует затрат на работу, чем экструзия цитохалаэином В, и дает способный к слиянию материал с высоким выходом. Четкое разделение "ядерных" и "цитоплаэмамембранных" фракций не достигается ни одним из обоих способов. Как содержащая преобладающе ядерный материал, так и также содержащая преобла дающе цитоплаэма-мембранные пузырьки фракция после слияния с человеческими лиифоцитами иэ крови дает хп чъйго способные размножаться, АК - продуцирующие клеточные клоны,Параллельная смесь ядра - лимфоциты - гибриды с и без добавки НАТ показывает отрицательные воздействия селекционной среды: с НАТ 233 первичных культур 1 я - отрицательно и 40 1 мму иммуниэ иро5 (40 мкг в1-й день)196-й день1 РА, интра помощь 1 2 Э 4 5 6 Ядерно-лимфоцитные гибридыкультивировано ация: Ва 1 Ь/с-мьппи первично вались с помощью-ЬТЯН СРА, интраперитонеально, и реиммунизировались на с помощью ЬТВН (50 мкг в перитонеально), на 266-й ден ЬТБН без добавок интраперито13 14неально, а также на 294-й день с помощью пТБН внутривенно,вКлетки селезенки (примерно 1 Х 10 )получают иэ одной из иммунизированныхмьппей спустя 3 дн после последнейреиммунизации, как в примере 1,п, Б,2, и используют по половинедля двух слияний,Слияние 1,.5 х 10 клеток Ая 8.653смешивают, подвергают слиянию, какпримере 1, п, Б.2, и культивируют в48 24-х ТцрГе 1 ("пятен") с помощьюклеток макрофагов мышей в содержащейНАТ ДйЕ 1-полной среде,Слияние 2, 1 х 10 клеток Ая 8.653подвергают лиэису, как в примере 2,благодаря постепенной обработке спомощью глицерина и 10 рМ трис-НС 1 буфера. Цитоплазма - мембрано-пузырьковая (СЮ) Фракция гранулируется (5,000 8, 40 мин, 4 С, Ядернаяфракция смешивается с 7 х 10 клетокселезенки, путем центрифугированиянаслаивается на СИУ-седимент и поспособу, как в примере 1, п, Б,2,посредством ПЭГ подвергают слиянию.Продукт слияния распределяют в ДМЕМполной среде на 24-х 24-ых СоягагТцрЕе 1 п (Соэг.аг-"пятен" ) .с макрофагами и культивируют без добавки НАТ,Специфическое для антигенов маркировки гибридных клеток клонирование: (Р 1 ТС) Сочаэрпегез ковалентно наносят с помощью ЬТБН (ТБН-СБ) и хранят в 57.-ном растворе азида натрия. Клет ки маркируют нанесенными СочаэрЬегеэ и "раскладывают с помощью цитофлюорографа крупные, обладающие положительной Флуоресценцией, клетки отдельно в ТцрГе 1 ("пятно") и 96-ые Соэаг пластины, Пятна (Тцрге 1)раньше (на 24 ч) покрываются мьппиными макрофагами в ДМЕМ-полной среде,ЕЬ 1 БА для ТБН - специфических антител, Покрытие, инкубация культу- ральной надосадочной жидкости, реакция субстрата и отделение,как в примере 1, и, Б.2. Вместо конъюгата мышиного антия-РОР применяют ТБН-РОР-конъюгат, В качестве положительного контроля используют сыворотку ЬТБН - гипериммунизированной мъппи, раэбавленную в 10 : в качестве отрицательного контроля служит клон, антитело которого образовано против непримененного антигена (антидигоксин мьппи)ЕЬ 1 БА для доказательства антиТБН в культуральной надосаточ"ной жидкости на 14-й день послеслияния (синтеза) а) слияние1(интактный А 8 8.653); б) слияние (синтез) 2(фрагменты Ая8.653); отрицательный контроль(ДИЕМ-полная среда):000; положительный контроль (анти-ТБН -мышинная сыворотка) : 362 20 25 30 1 2 3 4 5 6 236 212 149 119 212 221 119 104 176 068 108 135 139 093 135 128 120 228 137 145 А 235 В 109 35С 116 0 171 б) 40 2 3 4 5 6 45 А 271 268 267 286 191 291 В 288 278 362 317 280 305 С 207 29250 0 295 376 252 226 292 271 370 338 310 333 На 15-й день неслившиеся клеткииэ отдельных пятен слияния 1 и 2вымывают и раздельных основанияхмаркируют специфически ТБН-антигеном(основание: гибридомы как правило вкачестве В-лимфоцитов несут скреп 24744 14Таким образом, как в культурахиз слияния 1 (с интактными А 8.653 клетками), так и также таковые иэслияния 2 (с фрагментами Ая 8.653 лизиса) на 14-й день во всех пятнахпоявляются колонии больших лимфоидныхклеток.Результаты осуществленного на14-й день с культуральной надосадочной жидкостью ЕЬ 1 БА для доказательства ТБН - специфических антителэксперимента преДставлены в табл. 4(во всех частичных культурах прояв ляется анти-ТБН).Таблица 424744 40 3 4 1 2 А 000 000 В 000 001 45 С 000 000 011 000 000 004 б) 50 189 553 198 032 000 107 А 010 000 В 000 003 С 000 173 55 15 4 ленно часть синтезированных ими молекул антител в клеточных мембранах, вместе с направленными наружу местами связывания антигенов) и клонируют с помощью клеточного классификатора.П р и м е р 4, Слияние человеческого РВ 1. с интактными и фрагментированными АК 8.653 клетками.Инактивированный на поверхности Нераггягя-В-антиген (НВэ;, биотест) очищается путем иммуноадсорбции, протеинов сыворотки. Е 1. 1 БА для доказательства человеческих ЕВя -антител; пластины для микротитра покрывают очищенным ЕВ ; (20 ед./мл, 0,9 Х-ный раствор КаС 1), Инкубация культуральной надосадочной жидкости, реакции конъюгата и субстрата, а также отторжение, как в примере 1, и. Б,2. Вместо антимышиного 18-РОО используют овечий-античеловеческий 1 р-РОП. НРВ 1 донора с высоким анти-НВ3титром выделяют иэ 200 мл венознойкрови путем центрифугирования поградиентам Ргсо 11. Для увеличения(количества) В-лимфоцитов Т-клеткам придают форму с помощью овечьих эритроцитов и отделяют розетки спомощью второго центрифугированияс градиентами по Рсо 11. Фракциюнеобразующих розетки клеток(НРВ 1.(В культивируют при плотности 5 х 10 клеток в К РМ 1 1640 + 107. аутологичной плазмы (активируется в течение 30 мин при нагревании до 56 С) примерно с 10 мкг НВ в СОгинкубаторе (смена среды каждые 12 ч),7Слияние 1: 1 х 10 предварительно обработанного НРВ 1,(В) смешивают с 1 х 10 Ая 8.653 и, как в примере 1, п, В.2, подвергают слиянию посредством ПЭГ, Продукт слияния культивируют в К РМ 1 1640 + 103 человеческой плазмы + НАТ в 4-х 24-ых Соягаг - Тцр 1 е 1 п (Соягаг-"пятен" ).Слияние 2 х 1, 1 х 10 Аа 8.653 клебток фрагментируют с помощью глицеринового лиэиса, 1 х 10 Ад 8.653 ядер смешивают с 1 х 10 НРВ 1.(В) и наносят на седимент пузырьков мем-бранной цитоплазмы (из 1 х 10 Ая 8.653 клеток). После слияния с ПЭГ продукт слияния культивируют в 4-х 24-ых Соягаг-ТцрГе 1 п в К РМ 1 1640 + + 102 человеческой плазмы (без добавки НЛТ). Во всех пятнах слияния 1 и 2на 3-й день появляется сильный росточень крупных слипшихся клеток, 5На 5-й день основную массу не слипшихся клеток осторожно суспендируюти распределяют на две новые 24-еСоягаг ТцрГе 1 п (например, в А 1, В 1 иС 1). На 28-й день в слиянии 1: ма ленькие колонии в А 2 и АЗ, в остальных пятнах только слипшиеся клетки;в слиянии 2: массивный рост множественных колоний во всех пятнах, эаисключением С 3. Осуществленный с 15 культуральцой надосадочной жидкостьюна 35"-й день Е 1 15 А для доказательствачеловеческого иммуноглобулина со спе"цифичностью против Нераггг 1 я-В-антигена дает (см. табл. 5) результат: 20 слияние 1 (интактные Ля 8.653 клетки,культивирование в НАТ-среде) не даетникакой положительной культуры; напротив, 5 из 12 культур слияния 2(А 8 8.653 Фрагменты, культивирование 25 в нормальной среде) отчетливо антиНВ положительны.Таблица 5Е 1,1 ЯА для доказательства человеческой анти-НВя в культуральной 30 надосадочной жидкости в день 35после слияния: а) слияние 1 (интактный Ая 8.653); слияние 2