Способ получения антибиотика актиноплацина

20 25 30 последующей хроматографической очисткой. Однако, в литературе не известны получаемые по этим способам природные антибйотики, которые обладали бы одновременно высокой активностью в отношении всех групп грамположительных и грамотрицательных бактерийБОльшинство природных антибиотиков малоактивны или совершенно не активны в отйошенИи таких устойчивых. форм бактерий, как Рго 1 ецв и Р ее О с 1 оеопаз. В способе получения антибиотйка по. изобретению культивируют продуцентКсазаоа зресез штамм ВНИИА М 2079 вглубинных аэробных условиях при 27 +.1 С 35в жидкой питательной среде с рН до стерилизации 7,2 - .7,3 следующего состава, г/л.глюкоза 20-22сухой дрожжевойэкстракт 3,5-4,5 40солодовые ростки 1.5-2,5углекислый кальций 3,0 - 4,0Рода остальное,экстрагируют влажный мицелий этилацетатом в соотношении 1:3, извлекают антибиотик из полученного экстракта хлористымметиленом, целевой продукт очищают хроматографически на колонке с полиамидом иэлюируют его последовательно хлороформом и смесью хлороформа с метанолом в 50соотношении 80:20,Штамм Кйаэаюа зресез 2079 выделен; из почвенного образца Мг 11542 Аральскогорайона Казахской ССР.По своим морфолого-культуральным, 55физиологическим и антагонистическимсвойствам штамм отличается от всех известных в литературе видов рода Ксаза 1 оа.Антибиотик актиноплацин по своим физико-химическим свойствам также отличаетИзобретение относится к биотехнологии, в частности.к получению антибиотиков противобактериального действия медицинского назначения. Распространение резистентных к известным антибиотикам 5 штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий и повышение их роли в этиологии инфекционных заболеваний определяет необходимость поиска новых эффективных антибиотиков широкого спектра действия. Практическое здравоохранение испытывает острую нехватку высокоэффективных и малотоксичных антибактериальных препаратов," "Широкоизвестны по литературным источникам и на практике способы получения антибиотиков путем культивирования микроорганизмов на питательной среде, выделения целевого продукта экстракцией с ся от всех известных в научно-технической и патентной документации антибиотиков,Заявляемый штамм депонирован коллекцией культур микроорганизмов ВНИИ антибиотиков.По совокупности свойств штамма и антибиотика аналогов в мировой литературе на найдено,Морфолого-культуральные,физиологические. биохимические и антагонистическиепризнаки штамма Каэаюазрес ез 2079Морфологические признаки. Штамм 2079 формирует хорошо развитый воздушный и субстратный мицелий. На поверхности колоний образуются шаровидной формы спорангии разного размера от мелких до крупных (50 - 60 мкм в диаметре), внутри которых по 2 - 4 подвижных споры. Подвижность спор наблюдается в первые 40 мин, 1 час после выхода их из спорангия в дистиллированную воду, Кроме спорангиев культура образует и обычные спороносцы, типичные для 31 гертогпусез, Спороносцы спиральные (1 - 3 завитка), в спирали 12 - 20 спор. Споры прямоугольные, гладкие, 2 х 1 мкм,Культуральные признаки,Среда Чапека с крахмалом, Колонии круглые с фестончатым краем, д = 10 - 15 мм, выпуклые. Края колонии ровные Воздушный мицелий обильный, бархатистый от бледно-сероватого (а) до мышино-серого (а), Колонии кожистые, радиально исчерченные, центр растрескивается, По краю колонии беловато-сероватый ободок. Есть капли эксудата. Субстратный мицелий от песочного (л) до буроватого (б), Растворимого пигмента нет,Среда минеральная Гаузе М 1, Колонии круглые, плоские, края ровные, д = 14 - 17 мм, Воздушный мицелий обильный, бархатистый. мышино-серый (в), серый (в), по краю белый ободок. Субстратный мицелий темно-бурый (в). Растворимый пигмент отсутствует. Глицерин-аспарагиновый агар. Колонии круглые с валиком по краю, Валик плоский, центр колонии сильно приподнят над агаром. Колонии кожистые, складчатые, растрескивающиеся, радиально-исчерченные, б = 10 - 14 мм, Воздушный мицелий хорошо развит, серый (в), мышино-серый (а). Субстратный мицелий темно-бурый (в). Выделяет в среду темно-бурый пигмент, Встречаются более мелкие колонии б = 5-6 мм с бледновато-сероватым воздушным мицелием (а) ближе к белому, Субстратный мицелий темно-бурый, Крахмало-аммиачный агар. Колонии плоские, слегка выпуклые, 18396785 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 с = 15 - 18 мм, Края колонии равные, опущенные беловато-сероватым воздушным мицелием, Сама колония сильно опущенная,воздушный мицелий обильный, бархатистый, серый (в), мышино-серый (а), Субстратный мицелий темно-бурый (в-б).Выделяет в среду темно-бурый пигмент,Среда синтетическая Ваксмана, Колониикруглые, выпуклые с фестончатыми краямиб = 8 - 11 мм, кожистые, радиально исчерченные. Середина колонии сильно приподнятанад агаром, в центре углубление, центр растрескивается. Воздушный мицелий слаборазвит, сероватый, темнее (а-б), Субстратный мицелий желтовато-песочный, желтовато-бурый (д), Выделяет в среду слабыйбуроватый, буро-желтоватый пигмент.Среда синтетическая СРпо Красильникову, Колонии круглые с валиком по краю,складчатые, радиально исчерченные, кожистые, колонии приподняты над агаром, середина кратерообразная растрескивается,д = 10 - 14 мм. Выделяют в среду слабыйбуроватый пигмент, Воздушный мицелий отбледно-сероватого (а) до сероо (в),Кукурузная среда с крахмалом. Колониикруглые с фестончатыми краями, плоские,с = 10 - 15 мм. Колонии радиально исчерченные, складчатые, растрескиваются, в центреточечное углубление, Субстратный мицелийбурый, темно-бурый (в). Выделяет в средубурый пигмент. Воздушный мицелий обильный, серый (в), пепельно-серый. Мясопептонный агар, Колонии круглые, сфестончатыми краями, выпуклые. д = 5 - бмм, радиально исчерченные, центр в виденебольшого плато приподнят над агаром.Колонии голые, восковидные, восково-желтые ( оо 33). Выделяют в среду желтовато-буроватый пигмент (светлее д).Картофельный агар. Колонии круглые сослегка волнистыми краями, плоские, центрслегка приподнят над агаром, б = 10 - 17 мм,Воздушный мицелий обильный, темно-серый, (а) с крупными каплями эксудата,Субстратный мицелий темно-бурый (в-б).Растворимый пигмент бурый,Среда органическая с переваром Хоттингера. Колонии круглые с фестончатымикраями, выпуклые, кожистые, радиально исчерченные, кратерообразные, с = 8 - 12 мм.Воздушный мицелий обильный, бархатистый, бледно-сероватый (а). Субстратныймицелий темно-бурый (в-б), Растворимыйпигмент бурый.Овсяный агар. Колонии круглые, плоские, с = 10 - 14 мм, с обильным бархатистымвоздушным мицелием мышино-серого цвета (а). Субстратный мицелий оливково-серый (н). Пигмента растворимого нет,Физиологические признаки, Штамм разжижает желатину, но очень медленно (на 21 сутки), молоко не пептонизирует и не коагулирует, на клетчатке не растет, крахмал гидролизует, нитраты не восстанавливает, образует сероводород, Хорошо растет на картофеле, субстратный мицелий бурый, пигмент растворимый бурый, воздушный ми цел ий обил ьн ы й серый.На среде Придхема-Готтлиба штамм очень хорошо растет, если в качестве единственного источника углерода используют Д-мальтозу,-арабинозу, 1-ионизит, раффинозу, фруктозу, Д-ксилозу, хорошо растет в присутствии глюкозы, сахарозы, Д-маннита, лактозы, рамнозы, галактозы и очень слабо - в присутствии сорбита и крахмала, Биохимические признаки, В составе клеточной стенки штамма содержатся 1.1-изомер диаминопимелиновой кислоты и следующие сахара: глюкоза, рибоза, манноза, рамноза, галактоза.1 тип клеточной стенки по классификацииесЬеча 11 ег, Антагонистические признаки. При определении антагонистического спектра установлено, что штамм К 1 тазатоа зрес 1 ез 2079 подавляют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, актиномицетов, грибов и дрожжей,При глубинной ферментации культура К 1 тазатоа зрес 1 ез 2079 накапливает в клетках противобактериальный антибиотик широкого спектра действия. Способ осуществляют следующим образом.Биосинтез антибиотика проводили вколбах Эрленмейера на качалке (200-220об,мин) при 27 +1 С в течение 96 ч на средеследующего состава, г/л: глюкоза 20 - 22; сухо дрожжевой экстракт 3,5-4,5; солодовыеростки 1,5 - 2,5; углекислый кальций 3,0 - 4,0,рН среды до стерилизации 7,2-7.3,Через 96 ч ферментации антибис:-тическая активность штамма составляет 200,000ЕД разв,/мл в отношении ЯтарЬу 1 ососсцзацгецз 5 а, 3200 ЕД разв,/мл - в отношенииЕзсЬег 1 сЫа со 60 и Кебз 1 е 11 а рлецпоп 1 а 1122 и 6400 ЕД разв./мл в отношенииРзецсотпопаз аегц 91 поза 805 и Рготецзчц 19 аг 1 з 7470Антибиотик выделяли из впажного мицелия экстракцией этилацетатом. Этилацетатный экстракт упаривали до маспообразногоостатка, из которого антлбиотик экстрагиравали в хлористый метилен. Метиленхлоридные экстракты объединяли, высушивали надпрокаленным сернокислым натрием и упаривали до сухого остатка, Остаток промывалиэфиром, высушивали на воздухе и получалисырец антибиотика.10 Актиноплацин не растворим в воде, 20 4550 Затем сырец хроматографировали на колонке, заполненной полиамидом, используя в качестве элюентов последовательно хлороформ, до получения бесцветных элюатов, затем метанол и смесь хлороформ-метэнол (80;20). Установлено, что активное вещество мало растворимо в чистом метаноле и чистом хлороформе, однако его растворимость существенно повышается в смеу:и этих растворителей. Иэ вариантов смесей хлороформ-метанол 50:50, 10;90, 80:20 последняя оказалась наиболее приемлемой, поэтому она выбрана в качестве элюента активного вещества,Элюат, содержащий антибиотик, упаривали под вакуумом досуха, остаток дважды промывали хлороформом, сушили в вакууме, получали препарат в виде порошка желтого цвета. очень мало растворим в низших спиртах, хорошо растворим в смесях низших спиртов с хлорированными углеводородами. диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этилацетате. В = 0,45 +0,05 в системе хлороформ- метанол (80:20), По данным элюентного анализа содержит С - 58,5 О; Н - 4,6 Д; й - 8 43 /, Галаганы н сера отсутстеуют, По данным С - ЯМР-спектра молекула содер 3жит 42 атома углерода, т,е. с учетом элементного анализа молекулярная масса антибиотика 862, а эмпирическая формула С 42 Н 4 о 01 бй 4. Четкой температуры плавления актиноплацин не имеет.Спектральные данные актиноплацина представлены в табл,1.Вещество дает положительные реакции с хлорным железом, реактивом Эрлиха, отрицательные - с нингидрином Молиша.По совокупности полученных свойств эктиноплацин принадлежит к ароматическим антибиотикам, имеющим в своей структуре Фенольные ядра, сопряженные с ароматическими или гетероциклическими кольцами,Природных антибиотиков. содержащих в своей структуре у -хинолоновый цикл в доступной литературе не найдено,Из природных антибиотиков, содержащих в структуре хромоновый цикл, наиболее близки по совокупности физико-химических и биологических свойств такие антибиотики, как коумермицин и новобиоцин. Культуры рода Кйазатоа по данным литературы продуцируют антибиотик хлорамфеникол (Мазшвае Аната В. - ,Ап 1 Ыот. А - 1968, ч,21, р.616).От этих антибиотиков актиноплацин отличается по физико-химическим и антибио 30 35 40 тическим свойствам, данные которых приведены в табл.2 и 3.Выделенный антибиотик высокоэффективен в отношении большинства полирезистентных микроорганизмов - возбудителей заболеваний человека и животных.Спектр антибактериального действия актиноплацина включает различные виды грамположительных и грамотрицательных бактерий: стафилококки, цепочковые кокки, эшерихии, протеи, псевдомонады, ряд возбудителей острозаразных инфекций, в том числе устойчивые к другим антибактериальным препаратам (Гтабл.4).Антибиотик не токсичен, Ш 5 о составляет более 1000 мг/кг при пероральном введении мышам,Совокупность выделенных свойств актиноплацина определяет воэможность его применения при гнойной патологии человека и животных различной природы и локализации, инфекционных болезнях кишечника, септических процессах и др,П р им е р. Для получения антибиотика штамм 2079 культивировали при 27 ОС на качалке (и = 220 обмин) в колбах Эрлен- мейера емкостью 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего соы става, г/л;глюкоза 20дрожжевой экстрактсухой 4солодовые ростки 2углекислый кальций 4рН до стерилизации 7,2-7,3 ПродолжительностьФерментации 96 ч.Антибиотическую активность штамма определяли методом двукратных серийных разведений в МПБ (Государственная Фармакопея СССР, Х изд. - М; Медицина, 1968),По окончании Ферментации антибиотическая активность эцетонового экстракта из мицу лия составляла в отношении Зтарйуососсцз аогеоз 5 а 200.000 ед разе./мл, ЕзсйегсЫа со 1 60 и КеЬзейа рпеапопае 122 - 3200 Ед разв,/мл, Рзецдовопаз аегц 9 поза 805 - 6400 ЕД разв,/мл.По окончании Ферментации культуральную жидкость (Ч = 30 л) Фильтровали на фильтр-прессе, Получили 1,5 кг влажного мицелия (влажность 80%). Мицелий дважды экстрагировали 4,5-3,0 л этилацетата (соотношение 3:1 и 2:1), Экстракты объединяли, упаривали в вакууме до полной отгонки растворителя, Из 50 мл маслообразного остатка антибиотик дважды экстрагировали 0,1-0,05 л хлористого метилена (соотношение 2.1 и 1:1). Обьединенные экстракты вы-. сушивали над прокаленным сернокислым1839678 10 Таблица 1 натрием, упаривали досуха и промывали эфиром порциями 2 раза по 30 мл, Осадок высушивали на воздухе и получали сырец антибиотика в виде порошка темного зеленовато-желтого цвета, Из 1,5 кг влажного мицелия получали 1 г сырца антибиотика.Сырец затем хроматографировали на колонке (2,5 х 50 см), заполненной полиамидом, используя последовательно промывку хлороформом (100 - 500 мл) до получения бесцветных элюатов, затем метанолом (100 мл) и элюирование смесью хлороформ - метанол (80:20).Выход антибиотика из колонки контролировали с помощью ТСХ на силуфоле в системе хлороформ - метанол (80;20), антибиотика 0,45 .ф.0,05, Элюат, содержащий антибиотик, упаривали под вакуумом до полного удаления растворителей, остаток дважды промывали хлороформом (2 х 25 мл),отфильтровывали и сушили в вакууме. Получали 0,3 г антибиотика в виде порошка желтого цвета,Активность антибиотика (МПК) 0,00055 мкг/мл в отношении ЯтарЬуососсоз ацгеоз5 а; 0,15 мкг/мл в отношении Е.со 60,КеЬзеа рпеигпопае 122, Рзеобопзопазаегц 9 поза 805, Рготеоз но,цагз 7470,Варианты осуществ.-.ения заявляемого10 способа приведены в табл.5 и 6.Как видно из табл.5, при использовании, , и вариантов сред достигается максимальный уровень образо.;ания антибиотика, При уменьшении или увеличении15 концентраций компонентов среды уровеньобразования антибиотика снижается,(56) Матзопчае ет а А печч 9 епоз о 1 йеАс О погпусета Зез Кта атоа 9 еп, пон - ТЬе1839618Таблица 2 Сравнение физико-химических характеристик актиноплацина с другими антибиотикамиТаблица 3 Сравнение антибактериальной активности актиноплацина,новобиоцина, коумермицина, хлорамфеникола13 1839678 14 Таблица 4 Антибактериальная активность актиноплацина ММ пп Мик оо ганизмц Рз. Лцогезсепз Рз. серас 1 ае Рз, бв 1 пцта К 1 еЬз 1 еИа рпецщоп 1 аеЯегга 11 а вагсезсепз РгочЫепсае зтцапП ЯЬдеИа ИехпегЯавопеИа зоппе 0,015-0,03 0,15-0,3.з 1 ег 1 а щопосутодепезЕзсЬег 1 сЬа соИ Рготецз чц 1 даг 1 зРготецз гепдегЕптегоЬастег аегодепезРзецбовопаз аегцдпоза ВогбетеИа ЬгопсЬзербсцеА 1 саИдепез 1 аесаИзАспейоЬастег аоНе МПК антибиотика, мкг/мл 0.0005-0,001 0,07-0,15 0,03-0,06 0,03-0,06 0,15-3,0 0,1 5-3,0 0,15-0,3 0,15-0,3 0,25-0,7 0,03-0,06 0,03-0.06 0,03-0,06 0,15-0,3 0,3-0,6 0,3-0,7 0,15-0.3 0,03-0,15 0,03-0,06 0,015-0,031839678 МРпп Результат эксперимента етон 100% изкоактивный сыр иэкоактивный сыр 1:1 1:1 2 лучен маслооб дук и р Получен порошок био активный, лучшего кач цвету и растворимост илацетат Уменьшение жирных тилацета Порошкообразное вещество биологически активное, с ми нимальным количеством жир ных примесей и побочных компонентов лацета Гекса О истка омывка сырцролинейным эфи айтспиритом 1,2. Не улучшает качес учшает качест Хлорофор гическои ак тика, Присутжирных ствие Момплек слот определяли метода ЖХи ЯМР троскопии Зкстрагент/То жеАцетон 70% водныАцетон 70% водны ЭтилацетатАцетон 100% Этилацетат Хлористый метиле Соотношение влажный мицелий: этилаце- тат Коли- Кристалчество лиэация экстра- кций Получен порошоски активный Повышение биол тивности антиби Таблица 618 1839878 17 Продолжение табл. б Освобождение от посторонних примесей методом ТСХ,Метод не технологичен 3.1 3.2 Полиамид и промывка конечного продукта хлороформом 3.3 Формула изобретенияСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА АКТИНОПЛАЦИНА, заключающийся в том, что культивируют продуцент Ктазатоа вресез штамм ВНИИ А й 2079 в глубинных аэробных условиях при температуре 27 1 С в жидкой питательной среде с рН до стерилизации 7,2 - 7,3 следующего состава, г/л;Глюкоза 20- 22 Сухой дрожжевой экстракт 3,5 - 4,5 Составитель О, КузнецоваТехред М,Моргентал Корректор С, йекмар Редактор С, Кулакова Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035. Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Заказ 3412 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Препаративная хроматография на пластинах с силикагелемКолоночная хроматографияСиликагельПолиамид Низкий выходПолучен однокомпонентныйпрепарат. Методы анализаТСХ и ЯМР - спектроскопияОднокомпонентный препаратбез примесей жирных кислотс высоким уровнем активности Солодовые ростки ,5 - 2,5 Углекислый кальций 3,0 - 4,0Вода Остальнсе экстрагируют влажный мицелий этилацетатом в соотношении 1: 3, извлекают антибиотик из полученного экстракта хлористым метиленом, целевой продукт очищают хроматографически на колонке с полиамидом и элюируют его последовательно хлороформом и смесью хлороформа с метанолом в соотношении 80; 20,