Способ получения 2-кето-l-гулоновой кислоты

(71) Такеда Кемикал Инд(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИНОВОЙ КИСЛОТЫ Настоящее изобретение относится кспособу ферментативного получения 2-ке, то-.-гулоновой кислоты, применяемой в качестве промежуточного соединения всинтезе .-аскорбиновой кислоты.Известен способ получения 2-кето-:гулоновой кислоты из 0-глюкозы с использованием единичного бактериальногоштамма, полученного введением гена редуктаэы 2,5-дикето-О-гликоновой кислотымикроорганизма рода СогупеЬастегцгп вмикроорганизм рода Епаиа применениемметодов генной инженерии, Однако этотспособ неприемлем для использования впромышленности с точки зрения количествобразующейся 2-кето-:гулоновой кислоты,Наиболее близким техническим решением является способ получения 2-кето-:гулоновой кислоты путем культивированиярода РзецодцсопоЬас(ег в питательнойсреде с .-сорбозой,(57) Изобретение относится к способам ферментативного получения 2-кето-:гулоновой кислоты, применяемой в качестве промежуточного соединения в синтезе :аскорбиновой кислоты, Цель изобретения повышение выхода целевого продукта. Способ получения 2-кето:гулоновой кислоты включает культивирование микроорганизмов рода Рзец(одцсопоЬас 1 ег в питательной среде с :сорбоэой, при этом на стадии ферментации в питательную среду вносят редкоземельный элемент в количестве 0,000001-0,1 мас,ф, при этом в процессе культивирования поддерживают концентрацию- сорбозы 2-40;, рН среды 5-9 и температуру 25-35 С, а культивирование 3 осуществляют в течение 10 - 120 ч, 7 табл. Цел ь изобретения . - повь шение выходацелевого продукта,Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, включает, например,следующие штаммы, описанные в опубликованной заявке нэ Европейский патент %221707:Вец(одцсопоЬас 1 ег ЯассЬаго(е 1 одепезК 591:РЕЯМ ВР,3 РО 14464,Р з е ц с о 9ц с о п о Ь а с 1 е гЯасс)аго(е 1 одепез 12-5:РЕКМ ВР,20 25 30 35 45 Рзеобоц цсопоЬассегЯассЬагоесоцепез 12-3: РЕЯМ ВР,3 ЕО 14484,В последующем такие бактерии родаРзецбодцсопоЬастег Яассбагоетоцепезмогут называться бактериями окисления,Используемые в настоящем изобретении редкоземельные элементы включают,например: скандий (Яс), иттрий (У), лантан( а), церий (Се), празеодий (Рг), неодий (Иб), .самарий (Ягп), европий (Ец), гадолиний (Об),тербий (ТЬ), диспрозий (Оу), гольмий (НЬ),эрбий (Ег), тулий (Тп 1), иттербий (УЬ), лютеций (3 ц).Эти редкоземельные элементы могутбыть введены в виде металлического порошка или ила. Или же эти элементы могутбыть использованы в виде их соединений,таких как их хлориды, карбонаты, сульфаты,нитраты, оксиды и оксалаты. Элементы могут бытьиспользованы по отдельности илисбчетанием одного или более редкоземельного элемента, например, одновременномогут быть использованы карбонат церия схлоридом лантана. Кроме того, может бытьиспользовансырой продукт, полученный входе выделения и очистки соответству ощихэлементоо,Количество редкоземельного элемента,вводимого в культурную среду, выбира,ог втакбм интервале концейтраций, которые неингибируютрбст используемого микроорганизма, Какправило, эффективное количество находитсяв интервале от 0,000001 до 0,1,предпочтительно от 0,0001 до 0,05%(м а с. /об.).Что касается способа введения элемента в культуральную среду, то элемент можетбыть введен в культурную среду предварительно или же может подаваться периодически илй непрерывно в ходекультивирования,. В предлагаемом способе при добавле нйи к культуральной среде исходного продукта ( -сорбозы) все количество его можетбь 1 ть добавлено к культурной среде в началекультивирования, или ке Е-сорбоза может .быть добавлена несколькими порциями, илинепрерывйо к жидкой культуре, Концентрация Е-сорбозы в культуральной среде можетсоставлять 2-40% (мас,/об.), предпочтительно 5-30% (мас,/об.) в пересчете на культурную среду.В культуральной среде, используемойдля культйвйрования вышеуказанной бактерии окисления, источниками питания, усва- иваемыми бактериальными штаммами,являются источники углерода, источникиазота, неорганические соли, органические, соли и следовые питательные вещества. В качестве источника углерода можетбыть использована-сорбоза как таковая,Кроме того, в качестве дополнительного источника углерода могут быть использованы,например: глюкоза, фруктоза, глицерин, сахароза, лактоза, мальтоза, мелассы и т.п. Источники азота включают, например: различные аммониевые соли (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония), содержащие азот неорганические или органические соединения, такие как; замоченный кукурузный экстракт (далее сокращенно обозначаемый как ЗКЭ), пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соевая мука мука из хлопковых семян, мочевина и т.п В качестве неорганических солей в дополнение к вышеперечисленным солям редкоземельных элементов могут быть использованы соли калич, натрия, кальция,магния, железа, марганца, кобальта, цинка,меди и фосфорной кислоты В качестве следовых питательных веществ нельзя не указать на такие добавляемые вещества, являющиеся существенным фактором роста вышеуказанных бактерий, как СоА, пантогеновая кислота, биотин, тиамин и рибофлавин, Кроме того, может быть добавлен флавиновый мононуклеотид (далее сокращенно обозйачаемый ФМН), проявляющий промотирующее действие на рост и-образование 2-кето-гулоновой кислоты, другие витамины, Е-цистеин, Е-глутаминовая кислота, тиосульфат натрия и т.п, в виде отдельных соединений или содержащих их п 1 иродных продуктов.Эти компоненты культуральной среды могут быть предварительно добавлены в культуральную среду одной порцией, Или же часть этих компонентов или все их количество может быть добавлено в жидкуюкультуру периодически или непрерывно,В качестве способа культивированияможет быть использована стационарная культура, встряхиваемая культура или перемешиваемая культура и т,п. Однако для массового производства рекомендуется так называемая погруженная культура.Разумеется; условия состояния культуры меняются в зависимости от конкретного вида штамма, конкретного вида штамма, конкретного состава культуральной среды и т.п, Короче, условия могут быть выбраны для каждого конкретного случая такими, при которых целевой продукт может быть получен с наибольшей эффективностью, Например,рекомендуют температуру культивированияв 25-35 С и значение рН культуральной среды желательно в 5-9, 1788967При культивировании в рекомендованных условиях в течение 10 - 120 ч 2-кето:гулоновая кислота накапливается в самойвысокой концентрации, В этом случае, поскольку по мере накопления целевого продукта. значение рН падает, дляподдержания оптимального уровня рН, требуемого для микробиологического получения 2-кето:гулоновой кислоты, могут бытьдобавлены соответствующие основные соединения, например, гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак, Или же дляподдержания оптимального уровня рН ккультуральной среде может быть добавленасоответствующая буферная система.В настоящем изобретении при культивировании . микроорганизма родаРзецбо 9 исопоЬас 1 ег в жидкой среде, содержащей 1:сорбозу в присутствии редкоземельного элемента с образованием инакоплением 2-кето- -гулоновой кислоты вкультуральной среде, количество аккумулируемой 2-кето- -гулоновой кислоты можетбыть значительно увеличено путем смешивания вышеуказанной бактерии окисленияс другим микроорганизмом по сравнению сиспользованием одной только бактерииокисления, то есть микроорганизма, принадлежащего к роду Рзецбо 91 цсопоЬассег,Перемешиваемые бактерии включают,например, бактерии, принадлежащие к родам Вас 1 цз, Рзецс 1 огпопаз, Рготецз,9 тгоЬастег, ЕптегоЬастег, Егщ 1 п 1 а,Хапйогпопаз, ЕачоЬассегцп, МсЕососсцз,ЕзсЬегсЫа и т,п,Более конкретно используют плегующие бактерии:ВасШцз сегецз ЗЕО 3131,ВасШцз сегецз 1 ЕО 12201ВасИцзсЬепПогв 1 з 3 ЕО 12108,ВасИ 1 из гпе 9 атегцгп, ЕО 12090,ВасИцз рцтИцз ЛЕО 3022,ВасИцз атуоИс 1 цеГасепз . ЕО 13719,ВасИ 1 цз зцЬИз .ЕО 3967Рзецботопаз гпаИорЫИа 3 ЕО 12056Рготецз псозтапз ЛЕО 12692Рго 1 ецз 1 псопзтапз .ГО 12930,СКгоЬассег 1 гецпси . ЕО 13544,ЕмегоЬастег с 1 оасае 3 ЕО 3320.Епмиа ЬегЬ 1 соа,3 ЕО 12686Хаптпогпопаз р з 1, ЕО 13556ЕачоЬас 1 егцп гпеп 1 п 9 озербсцгп Л ЕО12535,М 1 сгососсцз наг 1 ацз 3 ЕО 3765,ЕсЬегсЫа соИ ЕО 3366,Жидкая культура, полученная культивированием любой из перечисленных бактерий в соответствующей среде при 20-40 Св течение 1-4 дней, может быть использована в качестве затравочной культуры подме 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 шиваемого микроорганизма. Как правило, рекомендуют применять для засева количество, составляющее 1/10-1/1000 от бактерии окисления (Рзецсо 9 исопоЬастег 1, При проведении смешанного культивирования путем подмешивания к бактерии окисления подмешиваемого микроорганизма в таком количестве, которое промотирует рост,бактерии окисления, в результате происходит окисление 1:сорбозы в 2-кето:гулоновую кислоту при более высокой концентрации сорбозы и в течение более короткого периода времени по сравнению с использованием одной только бактерии окисления, Бактерия, используемая в качестве подмешиваемого микроорганизма, желательно, не обладает или обладает слабой способностью ассимилировать-сорбозу, являющуюся исходным продуктом настоящего изобретения, или 2-кето- -гулоновую кислоту, являющуюся целевым соединением настоящего изобретения. Другие условия культивирования такие же, что и в случае применения одной только бактерии окисления.Кроме того, могут быть эффективно использованы и стерилизованные культуры определенных видов бактерий, отличных от вышеуказанных бактерий окисления, в качестве компонента культуральной среды. Используемые бактерии включают, например, бактерии рода Вас 11 цз. Рзецс 1 оаопаз, С 1 сгоЬастег, ЕзсЬегсЫа и Ега 1 п 1 а, Более конкретно используют следующие бактерии:ВасШцз сегецз ЛЕО 3131ВасИцз зцЬОз ЛЕО 3023,Ва И 1 цз рц т И из 3 ЕО 12089ВасИцз 1 пецасег 1 цгп .1 ЕО 12108 Вас Ииз ату 1 оИццеГасепз ЗЕО 3022 Рзецсопчопаз 1 гЮоИ, ЕО 12056 СтгоЬас 1 ег ГгецпсИ 3 ЕО 12681ЕзсбегсЫа соИ 1 ЕО 3546Егъап 1 а ЬегЬсоа ЛЕО 12686Эти бактерии могут быть культивированы в средах, в которых происходит их рост при 20 - 40 С в течение 2 - 4 дней, Полученная культура может быть стерилизована и добавлена к культуральной среде бактерии окисления настоящего изобретения в количестве 0,5 - 5 об./, с целью промотировать рост бактерии окисления,Образовавшаяся и аккумулированная в результате 2-кето-гулоновая кислота может быть выделена и очищена известными способами, основанными на использовании ее свойств.2-кето- -гулоновая кислота может быть выделена в виде свободной кислоты или же она может быть выделена, например, в виденатриевой, калиевой, кальциевой или аммониевой соли.В качестве способа выделения можетбыть использован, например, способ, в котором бактериальные клетки удаляют фильтрованием или центрифугированием помере необходимости, после чего растворконцентрируют с добавлением активиро ванного угля или без добавления его и отделением образовавшихся кристалловфильтрованием и их перекристаллизацией сполучением целевого соединения, можетбыть использована экстракция растворителем, хроматография, высаливание и т.п, Этиспособы могут быть использованы по отдельности, в сочетании или повтором.При получении 2-кето:гулоновой кислоты в свободном состоянии она можетбыть превращена. например, в натриевую,калиевую, кальциевую или аммониевуюсоль. а при получении кислоты в виде соли,та может быть превращена соответствующим способом в свободную кислоту или другую соль,Образующуюся в культуральной среде2-кето-гулоновую кислоту определяют спомощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии в следующих условиях.Условия проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии:ВЭЖХ - система 655 А.Колонка - ЯСН 101 Н (сульфонированный полистирольный гель), 300 х 7,9 мм.Скорость потока 0,8 мл/мин деление -50 кг/см,. Подвижная фаза - разбавленная сернаякислота (рН 2,1),Детектирование - УФ (214 нм) и дифференциальный рефрактометр,Время удерживания - 7,2 мин для 2-кето:гулоновой кислоты и 8,33 мин для 1 сорбозы.Нижеследующие примеры дополнительно в подробностях иллюстрируют настоящее изобретение, но без ограниченияего объема. Все приведенные для культуральных сред процентные отношения даныв мас,/обесли нет особых указаний. Выхода для культур в примерах соответствуютмольному выходу 2-кето-гулоновой кислоты в пересчете на используемую 1.-сорбозу,П р и м е р 1, Среду затравочной культуры (20 мл), содержащую 2% О-глюкозы, 1%пептона, 1% сухих дрожжей и 2% СаСОз,помещают в колбу Эрленмейера на 200 мли выдерживают 20 минут при 120 С в автоклаве. Колбу засевают одной петелькой штаммаРзеободосопоЬассег ЯассЬагоесоцепез (1 ЕО14464. ЕЕВМ ВР), выращенного в средескошенного агара (табл,1) при 30 С в течение3 дней и культивированного при встряхивании (200 об/мин), при 30 С в течение 2 дней. Полученную культуру (2 мл) переносят в ту же среду, что была описана выше, и культивируют в тех же условиях с получением второй затравочной культуры В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ,0,5% сухихдрожжей,0,3% сульфата аммония, 0,05% 1 чагЯгОз .5 НгО,0,1% ЕеЯ 04,7 НгО, 0,005% СеСз.7 НгО, 3,5% 10 щают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония. 0,05% йагЯОз.5 НгО, 0,01% ЕеЯ 04.7 НгО. 0,05% Сег(СОз).8 НгО, 3,5% СаСОз (Ака бапза) и 9,5% 1-сорбозы(стерилизуют отдельно), и выдерживают в автоклаве 20 мин при 120 С,Каждую из вышеуказанных вторых затравочных культур(1.25 мл) помещают в колбу Эрленмейера, содержащую ферментативную среду, и культивируют 3 дня при встряхивании и 30 С. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. 40 45 50 Полученные результаты приведены в табл.2, где указаны количества образовавшейся 2-кето:гулоновой кислоты (мг/мл) вместе с количествами, полученными при культивировании в среде без добавления Се(СОз)з П р и м е р 3, Штамм Рзеобоц 1 цсопоЬас 1 ег ЯассЬагоейоцепез ТН 14-86 (3 ЕО 14466, ЕЕВМ ВР) культивируют по методике,СаСОз (Ака багпа) и 9,5% 1-сорбозы (стерилизуют отдельно) и выдерживают 20 минпри 120 С в автоклаве,Полученную среду засевают вышеука 15 занной второй затравочной культурой (1,25мл) и культивируют при встряхивании и 30 Св течение 2 дней, Полученный в результатеферментативный раствор содержит 86,4мг/мл 2-кето:гулоновой кислоты (выход20 84,4%) в соответствии с анализом с помощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии, Ферментативный раствор,полученный в результате культивированиятем же способом, но без добавления в среду25 хлорида цезия, содержит 51 мг/мл 2-кетогулоновой кислоты (выход 49,8%),П р им е р 2. Штаммы РзецбоосопоЬасегЯассйагосе 1 оцепез 12-4 (3 ЕО 14483, ГЕВМВР), 12-5 (,ЗЕО 14465, ЕЕВМ ВР),30 12 - 15(1 Е 0-14482, ЕЕВМ ВР) и 22 - 3 (,3 ЕО14484, РЕВМ ВР) культивируют способом примера 1 с получением вторых затравочных культур.В колбу Эрленмейера на 200 мл помеописанной в примере 1, с получением второй затравочной культуры,В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 глл), содержащую 2% 3 КЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония. 0,05% йа 2.320 з,5 Н 20, 0,1% РеЯОл, 5% СаСОз (Ака сото) и 10,5%-сорбозы (стерилизооана отдельно), и выдерживают 20 минут в автоклаве при 120 С. Вышеуказанную вторую эатраоочную культуру (1,25 мл) переносят в колбу Эрленмейера с ферментативной средой и культивируют 2 дня при встряхивании и 30 С. В этих условиях культивирование встряхиваемой культуры проводят путем добавления 0,01% хлорида иттрия, лантана, церия, неодия, самария, европия, гадолиния, тербия, диспрозия, гольмия, эрбия или иттербия, или оксида празеодия или 0,05% оксида скандия при 30 С в течение 2 дней. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.Количество образовавшейся 2-кето-.- гулоновой кислоты в культуральной среде (м г/мл) и ри ведено в табл.3..П р и м е р 4. По методике примера 1 культивируют штамм РэецбоуцсопоЬассег ЯассЬагоЕео 9 епез ТН 14-86 использованием той же ферментативной среды, что и в примере 1, в которую добавлен оксид, хлорид, карбонат, нитрат или оксалат лантана, или оксид, хлорид. сульфат или карбонат, нитрат или оксалат лантана, или оксид, хлорид, сульфат или карбонат церия в количествах, указанных в табл 4, В данном случае время культивирования 30 чКоличество образовавшейся в ферментативном растворе 2-кето- -гулонооой кислоты (мг/мл) определяют с помощью высокоэффективной кидкостной хроматографии.Полученные результаты приведены в табл.4, где также даны результаты для культур без добавки редкоземельного элемента,П р и м е р 5, Микробиальные клетки ВасИцэ п 1 едасегцт (ЗРО 12108), выращенные в среде скошенного агара (состав в табл.1) при 28 С о течение 2 дней, суспендируют о 10 мл стерилизосанной воды и осе количество переносят в колбу Сакагучи, содержащую затраоочную культуру примера 1 (500 мл), и культивируют при возвратно-поступательном встряхивании (85 встряхиваний о мин) и 28 С в течение 2 дней с получением затравочной культуры ВасИцв гпеца 1 егца. Среду (30 литров, рН 7), содержащую 4% сахарозы, 0,65% У 2 НР 04. 0,05% сульфата аммония, 4% муки хлопковых семян, 0,05% МаС, 0,05% У 950 л.7 Н 20 и 0,05% кальциевой соли пантогенооой кис 355055 мл с эатравочной культурой примера 2 (20мл) высевают одну петельку микробиальных клеток ВасИцэ гпецаегцго Л РО 12108, оыращенных в течение 2 дней при 28 С на среде скошенного агара, и подвергают культивированию при встряхивании и 28 С в течение2 дней с получением культуры подмешиваемого микроорганизма.-сорбозу (72 г) растворяют в воде до объема о 300 мл, после чего о воде растворяют или суспендируют ЗКЭ (60 г), сухиедрожжи (6 г), сульфат аммония (9 г), Ге 250 л.7 Н 20 (3 г), ФМН (3 мг), тиамин (3 глг), биотин (1,5 глг) и актокол (0,5 г) до общего объема в 800 мл, Отдельно суспендируют в воде до объема 1000 мл СаСОз (240 г,Асасагпа) и Се 2(СОз)з.8 Н 20 (150 мг), После выдерживания каждой из сред 20 минут в аотоклаве при 120 С их загружают в ферментатор на 5 литров, который предварительно стерилизуютВторую затравочную культуру вышеуказанного штамма ТН 14-86 (300 мл) и затравочную культуру подмешиоаемого микроорганизма (4 мл) оысевают в ферментатор и начинают культивирование в следулоты, загружают в ферментатор на 50 литров и выдерживают в автоклаве 20 мин при125 С, Ферментатор засеивают затравочной культурой ВасИцэ гпецатег 3 цгп (1 л) и5 культивируют 4 дня в следующих условиях:перемешивание 200 об/мин, аэрация - 24л/мин, внутреннее давление 1 кг/см, температура 28 С, Полученнуо культуру выдерживают в автоклаве 20 мин при 120 С,10 хранят о холодном месте и в качестве одногоиз компонентов ферментативной среды используют стерилизованную культуруВасИцэ гпедатегцп (далее называемой мега-бульоном).15 Затраоочную культуру примера 1(20 мл)помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл ивыдерживают 20 мин в автоклаве при 120 С,Одной петелькой микробиальных клетокРэецбо 9 цсопоЬастег ТН 14-86, выращенных20 на среде скошенного агара (состав табл.1)при 28 С в течение 4 дней, засевают содержимое оышеуказанной колбы и культивируют 2 дня при 30 С и встряхивании,Полученную культуру (20 мл) помещают в25 колбу Эрленмейера на 1 л, содержащуюкультуральную среду (200 мл), в которой содержится 2% О-глюкозы, 3% (об,/об.) мегабульона, 1% ЗКЭ, 0,5% дрожжевогоэкстракта, 0,1% пептона, 0,3% сульфата ам 30 мония н 2% СаСОз(Асас 1 агпа), и культивируют 2 дня при 30 С и встряхивании сполучением оторой затраоочной культурыштамма ТН 14-86,Отдельно о колбу Эрленмейера на 200ющих условиях: температура 30 С, аэрация 2,4 л/мин, скорость перемешивания 800 об,/мин,Отдельно растворяют в воде до объема 900 мл .-сорбозу (528 г) иаСз,7 Н 20 (150 мг). Растворяют в воде до общего объема в 100 мл сульфата аммония (6 г) и РеЗОа.7 Н 20 (3 г). Полученныерастворы выдерживают 20 мин в автоклаве при 120 С, после чего смешивают в асептических условиях. На 6-й час после начала культивирования эту смесь непрерывно добавляют в ферментатор и добавление заканчивают за 24 ч, После завершения добавления смеси культивирование продолжают еще 8 ч (общее время культивирования 38 ч), За это время усвоение :сорбозы в культуре полностью завершается и в результате получают 3,16 литра ферментативного раствора, содержащего 176 мг/мл 2-кето- -гулоновой кислоты (выход 86%).Отдельно в вышеописанных условиях проводят культивирование, однако ни Се 2(СОз)з,8 Н 20, ни .аСз.7 Н 2 О не добавляют. В этом случае при продолжении культивирования еще 22 ч после добавления смеси происходит полное усвоение-сорбозы (полное время культивирования 52 ч), В полученном в результате ферментативном растворе (3,09 л) содержится 161,4 мг/мл 2-кето.-гулоновой кислоты (выход 77,1%),П р и м е р 6, К перемешиваемому ферментативному раствору примера 5, содержащему 176 мг/мл 2-кетогулоновой кислоты (1 л), добавляют примерно 260 мл 6 И серной кислоты и образовавшиеся нерастворимые вещества, такие как сульфаты и клетки, удаляют центрифугированием, Полученный раствор (1150 мл) пропускают через колонку, заполненную катионообменной смолой 1 Я 120 В (Н -тип) (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Элюат и промывные растворы объединяют и пропускают через колонку, заполненную углем для хроматографии (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Объединенный раствор элюата и промывных вод (1450 мл) концентрируют до 250 мл при пониженном давлении и примерно при 500, Концентрат оставляют на сутки при 5 С с отделением 2-кето-:гулоновой кислоты, Образовавшиеся кристаллы отделяют фильтрованием, промывают небольшим количеством охлажденной воды, 50%-ным холодным метанолом и холодным метанолом, Полученное вещество сушат над пятиокисью фосфора при пониженном давлении с получением 156 г (выход 81,1%) бесцветных кристаллов моногидрата 2-ке то- -гулоновой кислоты, Температура плавления 171 С (с разложением).Элементный анализ для СвНоОт. Н 20(с=1,0, Н 20)П р и м е р 7, Одной петелькой микроби 10 альных клеток штамма РзецбодосопоЬас 1 ег 15 2025 30 35405055 ЯассЬагоЕе 1 одепез ТН 14-86 засевают колбу Эрленмейера на 200 мл со средой (20 мл), содержащей 2% О-глюкозы, 3 об.% мега- бульона, 1% ЗКЭ, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% пептона, 0,3% сульфата аммония и 2% СаСОз и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30 С и встряхивании, Полученную культуру (2 мл) переносят в колбу Эрленмейера на 200 мл с той же средой (20 мл) и культивирование проводят тем же способом с получением второй затравочной культуры бактерии окисления,Ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% 3 КЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% Ма 2520 з.5 Н 20, 0,1% Ге 304.7 Н 20, 5% Са СОз и 12,5% :сорбозы (стерилизуют отдельно), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 мин в автоклаве при 120 С. Отдельно стерилизованный СеСз,7 Н 20 в количестве, указанном в табл,5, добавляют в колбу Эрленмейера, содержащую вышеприведенную ферментативную среду, и содержимое колбы засевают вышеописанной второй затравочной культурой(1,25 мл) и затравочной культурой подмешиваемого микроорганизма, приготовленного в примере 5 (0,1 мл).Количества образовавшейся при культивировании встряхиванием ферментативного раствора (ЗОС. 3 дня), 2-кетогулоновой кислоты приведены в табл,5.П р и м е р 8, По методике примера 7культивированием штамма ТН 14-86 бактерии окисления получают вторую затравочную культуру, Ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% 3 КЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05%Ма 230 з.5 Н 20, 0,1% РеЯОд.7 Н 20, 2,5% СаСОз и 7,5% .-сорбозы (стерилиэуют отдельно), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Отдельно стерилизованный СеСз.7 Н 20 в количестве, укаэанном, в табл,6, помещают в колбуЭ рленмейера в указанную ферментативную среду, которую засевают выше приведенной второй затравочной (1,25 мл),Количества 2-кетогулоновой кислоты (мг/мл) в ферментативном растворе, пол13 1788967 Таблица 1 Таб ифры в скобках означают усредненный выход,ученном культивированием встряхиванием при 30 С в течение 3 дней, приведены в табл.6,П р и м е р 9. По методике примера 7 культивированием штамма ТН 14-86 бактерии окисления получают вторую затравочную культуру. Ферментативную среду (20 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% йа 2320 з.5 Н 20, 0,1% Ге 0 а.7 Н 20, 5% СаСОз, 12% 3 -сорбозы, а такжедобавки, указанные в табл,7, в соответствующих количествах помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Содержимое кол. бы засевают вышеуказанной второй затравочной культурой (1 мл) и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30 С и встряхивании. Количество образующейся 2-кето-Е-гулоновой кислоты (мгмл) в полученной культуре определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии,Полученные результаты приведены втабл.7, где также указаны результаты, пол ученные при культивировании без добавок. Формула изобретения Способ получения 2-кето:гулоновойкислоты путем культивирования микроорга-10 ниэмов рода РзеобоццсопоЬастег в питательной среде с-сорбоэой, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, на стадии ферментации в питательную среду вносят 15 редкоземельный элемент в количестве0,000001-0,1 мас.%, при этом в процессе культивирования поддерживают концентрацию :сорбоэы 2-40%, рН среды от 5 до 9 и температуру 25-35 С. а культивирование 20 осуществляют в течение 10 - 120 ч,1788967в скобках означают усредненный выхо скобках означают усредненный выход. 16 Таблица 3 а1788967 18 17 Таблица 5 ы в скобках означаю ненный выход ица 6 Цифры ках показывают ус нныи выход,аблиц оставитель Н,Афанасьеваехред М,Моргентал Корректор Э.Лончакова дактор Заказ 82 Тираж ,.Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 оизводствен