Способ получения фермента, фиксированного на твердом носителе

О П И ью А ь-Е+ки ИЗОБРЕТЕНИЯ Совз Советских Социалистических Республик(21) 1969516/1 б 7/О Государственный намнт Совета Инннатрав ССС па делам нзабретеннй н атнрытнй(33) Франци О 5 76 " ю, еанин описания ень Ле 191(531 л 10 6 т ЛК 577.15.08Иностранцы Жан Луи 72) Авторы изобретения Фоссати рис, Рене Пооцэн и П н Поль Бурдо,(ФпиляИностра иая фир Сосьете Насьональ(71) Заявите Ытрсчь д :;гч э . 4) СПОСОБ П ЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕ, : , ФИКСИРОВАННОА ТВЕРДОМ НОСИТЕ,ПЕ и/или до 4 ции целлюл е жанне х хлооа ичем при использоваашей серу и хлор, сонтнои прсподученияиспользуе сится к ферме тся способов и сычужного, ния сыра, фикс еде. Фиксирова ение отно ы, содер .ав мо шленности и кас;мента, в частност м юлозы ни о для приготовле ла твердом носит ированноние фервозмож -м особу цел.25 вес.",чистот фиксиро -вля стп окончания ь фермен оъ е комплев воде стивной акт ироваесте ют дисстворатузу с пособы фикс носителе, И й фер -абильные, с хо римые мента ивностью, Испол посс ба позволит ование пр едлага ем ог рном р и темп целлюл омываю чат уктлтель пр зн ободньщ о ентов, ичедних.юлозы, пр мет номию пос,ю э и/ил Сульфо осташе хлорнияощью годные твле поу едлага любых пример чив емого спос получают с рир ющих а фором Р С циноилом и и в особен х хи ом ф извести ь хлор ист гентов, наБ, РСЮ5 в.сно предлож я активност ксалилхлори м, сук слотой у с цельюферм енвщую ьокислов 25 ному способ и стойкости Согл ыщен скои к угои ргани охлор ли д пост сульф льзуют целлю лекуле до 7ов исп воей м лозу, содерж 4 серы в вид ванными аге ми,(22) ЗаЯвлено 14,1 1.(45) Дата опублико ментов на твердом носителе даетность, с одной стороны, обеспечитготового продукта путем вывода заванных ферментов из среды послепроцесса, а с другой - расходоватты экономно,Известны различные сния ферментов на твердомспособ, согласно которому осущепергирование целлюлозы в буфере фермента при рН 50-10 Ооре 0-45 С, а затем отделяютФиксированным ферментом и пр11, Однако такой способ не обеспполучения достаточно активных и стферменто д лор лекуле цедл же содержанл я в ней серы.Применяемая согласно этому сп люлоза должна содержать от 5 до лигнина, диспергнрованпого в ее массе.Настоящее изобретение позволяет осущесть фиксацию различных ферментов, в чаости, протеаз (и в том числе сычужного фермента) на целлюлозе и получать при эт тверды ксные соединения, не раствоЦеллюлозу предварительно обрабатьтватотщелочным рястБОром, еаГе 4 прОМЫВают идиспергируют в органической жидкости (неитрапьной или слабоосетовной), После введе -ния агента хлорирования В дисперсию целлюлозы В течение нескольких часов при темпеоратт,1 те предпочтительеео 10-55 С осушестн Лвпяют вьшержку реагиру;оших систем, а затем целпюнсзу выделяют, промывают и нринеобходимости сушат, Целесообразнее доеав-.ПЯТЬ ХЕЕОРИРУЕОЕИИй ЯГЕНТ К ДнсттЕРСИИ ЦЕЕЕЛКЗЛОЗЫ ПОСТЕПЕННО.Зятем осушествляеот контакт обработанной целлюлозы с буферным раствором фер -мента пои рН последнего 5,0-10,0 и темОнерат.тре ниже 45 С, Длительность коптакЕтя,"111 я фиксатии фермси 1 та ня целлЕОЛОзе 24 ч иЕСтт 111 тЕЕСТ 110 РЯСХОДУЕМОГО фЕРМЕЕтта К ВЕСУ ЯКтИВИРОВЯННОй ПЕЛЛКЕЛСтЗ 11 СОСтаВЛЯЕТ1 - 60 Вес, о.К группе ферметттов спосООных даватьКОМПЛЕКСНт,тЕ СОЕДИНЕ 1 ИЧ С ЯКТИВЕЕРОВЙНЕЕОЙцелтпопозой, Относите 1 иетверта:тат, амилазя,мальтгт 11 а 11 ЕКТиттттэтт, ЛротЕаэы, пептидазьТрИПСИН, ХИМОТрИПСИЕт, ЛИЗОПИт фосфотаЗЫ,рибонуклеазы. Особое место з нимагот сычтт)ки ый ферм Рнт, бета-гя летн т тдаза и хим О -тринсин. Желательно, чтттбы 1. тлюлозный носеттепт-, содержал Око.то 5-25% лигпина поВесу сухого Вееетества(ля получения такойие:тлюлозы можно использовать тцепу, опилки, со:тому, а также бумажную массу приусловии содержания пигетина В укязапныхПРЕДЕЛОХ. тттОжЕЕО ПРИМЕтИтЬ ТаКжЕ СГЕРжииНОЧ 11 ТКЯ КУКУРтУЗЫ. т ЯЗМЕР ЧЯСТИЦ ЦРЛЛЕОЛОзы - От 0,2 мм до неско;тьктех сантиметров(предпочтительнс 0,5-5 мм),Наиболее хорошие результаты иолучаеотетри использовании стержней початка кукуру зы В кусках 0,5-10 мм, обработанных хлорилом тиоиила в присутствии избытка пири 1 т,дина и содержащих в готовом виде 2 - 6серы и хлора менее 1%.1 ТОбт,е получить фРрмРетт, фиксирОВаттныйна лигттифицированпой целлтолозе, послелетюео(СотЕЕРжаПЛтЕО ЛИГЕЕИН) ИЗМЕЛЬЧЯЮТт ПОЛУЧЕНные куски Обрабатывают ветачале щелочньтемраствором, растворяя находящийся на их поверхттости лигнин, затем куски (зерна) цел люлозы промывактт холодной водой, Обезвоживактт спиртом и промывают пиридином,Вводя в суспензию хлорид тионила и псддер живая темттературу на уровне 55-60 С, Сгутя час суснензию охлаждают, Вьеделяеот зерна, промывают водой, затем растворо.л кислоты с рН близким к 2,0 спиртом и сут 11 лтпри температуре ниже 50 С.Нанесение фермента на полученньей но тт-.тель осуществляют в среде буферного водного раствора при рН 5,9-6,4 и температуре 2,"1-.1 ф С ", течение 24 час, Затем зерна с. т Еоет .ОЕЬГтт тттзрМЕПТОМ ВшцЕЛНЮт, ПрОМЫВавтбутт ерным раствором с соответствующим рНп.водой, Хряетить полученные зерна рекомендуется при относительно низкой температуреВ буферном растворе при рН, обеспечивающем устойчивость фермента.П р и м е;.: 1, Хлорирование целлю -позы в присутствии пиридина,Цет 1 люе 101 у В кегтичестве 32,4 г обра;:.;Твтвапн 16 ж-ЕЕЫМ ВОДНЫМ растВОрОМ ГИдрооттиси театртм - течение 2 час. Затем ееПРОМЫВали МЕТаЕОЛОЛ Дто тЕХ ПОР, ПОКаФильтраты перестанут быть Основтеыми, игтеертедттттом. После этого ее суспендируютв ЯОО мл гтирид:".н. К суспензии добавляеет 146 мл хлорида тионила с чистотой99", и Оставпетют в покое 4 час, поддероживая 28 С. Спустя это Время получен -ную смесь вносят в ванну ледяной водыи птереметнивтктт 1 час, Затем целлюлозуОтфитрттт-;Ы;ЯННГ И ГОТОВят ИЗ НЕЕ И ИЗРЯСГВОРтт ПОЛУНЯСЬ.Е;ЕЕНКОГтт ДВУУГЛЕКИСЛОГОНатРИЯ С ГСЕтвттэтпэт КОТОРУЮ ЧЕРЕЗ СУТКИпромьевают Водои. Полученную целлюлозусутттат 24 ч: ". При 50 С, Б чей содержится 3,57% хттор н 4,4% серы,Опытами , - Иовлено, что в среде пиридина сера фик ируется на целлюлозе втечение первоггт часа реакции и если опе,орацию продолжать при 23 С, то содержаНИЕ ЕЕ ПОНИжаЕтСя Ет,".ОЛИЧЕСТВО фИКСИрО -вяштого хлора наоборот повышается спустя110 рт-" т -;.т 1."ЕЯЕ11 т.П р и м е р 2, Х 110 рирование целлюлозы в присутствии дит ксана,Готовят суспензию,;:; 6."., г целлюлозыи 450 мл диоксина, Добаь. яют 30 мл хлорида тийпила, После 1.:тасс реакции смесь"игтьтруют, про:,:т,:вгтот в.,.:.и сушат. Содержание хлора В целлюл 030 1 5 1 %. Еслиповысить количество хлорида тионила приполучении реакционной смеси (или времяреакции), то содержание хлора в целлюлозе не увеличивается,П р и м е р 3. Обработка целлюлозыХЛООИ"ТЫМ СттпьтЕЕИРИЛОМОбработку целлюлозы ведут аналогичнопримеру 1, но Вмегто пиридина используктт 44 мл хлористого сульфурила, т. е.3,50 моля.П р и м е р 4. Обработка целлюлозы вприсутствии трихлорида фосфора.Обработку целлюлозы ведут аналогичнопримеру 3, но используют 50 мл трихлорида фосфора, т, е, 0,6 моля,П р и м е р 5. Обработка целлюлозыпентахлоридом фосфора,Процесс осуществляют аналогично примеру 4, но используют 62,5 г пентахлорида фосфора или 0,3 моля, предваритель но растворенного в диоксане. Таким образом, используют оцновременно пиркдкн к диоксан.П р и м е р 6, Приготовление комплексного соединения целлюлоза-сычужный фермент,Сульфо-хлорированную целлюлозу в количестве 16 г, согласно примеру 1, вводятв контакт с 40 мл раствора промышленного сычужного фермента, разбавленного пятикратным количеством буферного раствора10фосфата при рН 6,2, Поддерживают темпеоратуру между 4 к 6 С при перемедткваник.Спуотя 48 час целлюлозу промывают в250 мл буферного раствора фосфата прирН 6,2 250 мл вагонного раствора хлоркстго натрия (5 молей/питр) и 250 мл воды.Затем комплексное соединение снова суспендируют в 250 мл буферного раствсуаацетата прк рН 4,4 температуре 4-6 С иперемешиваник в теченке 1 час,Эту обработку проводят для десорбцикковалентной связью не фиксированной фракции фермента. После новой фильтрации нерастворенный фермент возвращают и суспенцируют с 250 мл буферного раствораЖацетата в течение 20 час. После послед -ней фильтрации подученное комплексное соединение целпюлоза-сычужный фермент диспергируют в 100 мл этого буферного раствора ацетата при рН 4,4 и оно сохраняется в холодильнике при 4-6 С, Актинось16 г этого комплексного соединения эквивалентна 0,12 мл промьдцленного сычужного фермента.П р и м е р 7. Комплексное соединенкеЗЬцеллюлоза-хкм отркпсин.Вводят в трубки из пластмассы для центрифуги 500 мг целлюлозы, обработаннйсогласно примеру 2, добавляют 10 мп буферного ферментативного раствора при рН 9(борная кислота, /хлористый калий/ хпоркстый натркй), обозначенного маркой "тктризоп, Трубки помещают на вкброшкт на 10мин при комнатной температуре, Затем процсизводят их центрифугкрованке в течение20 мин со скоростью 2500 об/мин. Уда -ляют вспльвшую часть, осадок промьваютдля десорбции части фермента, которая нефиксировалась, 10 мл раствора хлористогонатрия, содержащего 5 молей хлористогонатрия на 1 л, После перемешквания сновапроизводят центрифугирование в течение20 мин. Остаток обрабатывают буфернымраствором при рН 8,5, известным под названием "трис", состоящим из аминогидроксиметиппропандиол,3, и 10 мл титризола при рН 9,Проводят еще две промьвки, после чегообработанную целлюлозу сушат.Протеолитическая активность полученно г -,. г" чхо -омп;г;ксногсоедг кения опре депяется ка казенке ггок рН 8,5 к темпеоратуре 37 С, Дпя этого в коническую копоу вносят 800 мг комплексного соедине - ния и 20 мп раствора казекна (кли снятого молока), спустя 10 мнн отбирают 10 мл раствора, который выпквают в г.робкрку, содержащую 10 мл тркхпоруксусной кислоты дпя остановки реакции. Затем кробкр - ку помешают на 1/2 час в ванну, где пододеркжвают 37 С, дпя осаждения всего казенка, который не бып гицролизован. Фильтруют и опрецепяют количество выделен - ного тирозкна измерением оптической плотности фипьтрата прк длине волны 27504. Таким образом. находят, что активность 500 мг комплексного соединения пеллкьлозахимотрипскка саавнкмг с активностью 08 мг свободкого трипснка по отношению к 10 мл снятого молока в тех же успо -П р к м е р 8. Комплексное соединение тркпскн-целлюлоза.4 г носигепя, приготовленного сглас- но примеру 2, вводят в коническую колбу с 80 мп ферментатквного раствора, содержащего 200 мг токпсипа к 100 мп буферного раствора титркзола при рН 9. Перемешивают в термос,ате к оставляют на 10 мкн пок 37 С, Зато.; фильтруют на фритированном стекле к промьвают ком - плексное соедккенк-. 70 мп водного раствора с 5 моля:кк хпоркстого натрия ка 1 п. Вторую к третью промывки:гроиоцк; соответственно с 50 - , 30 мп гого же рагвора хлористого натрия. Г опччеккоо комплексно соедк ецке ссгзакяют в бч - ферном ра-,гворе "тркс" прк рН 8,:, Протеолкткческая активность 500 мг комплекского седкпеккя, кределекная ка казекке при рН 8,5 к 3 7 С, соответствует активности 0,4 ;1 г свободного тркпскка,П р к м е р 9. Комплексное соединение бета-галактозкдаза-целлюлоза,К 13 г модифицированной согласно поимеру 1 целлюлозы добавпчюг 40 мл ферментатквного раствора. разбавленного в 10 мг. буферного раствора прк рН 72, состоящего кз 10 моль/л фосфата калия к 10-г. -3. моль/и хлористого магния, Ферментатквньгй раствор представляет собой целлюларный экстракт Е 5 сЬесйо. Соь К 12, очищенный путем осаждения сульфатом аммония, содержащий 1800 ед. о-нитрофенкл-бета- галактопиранозкда (О. Н. П. Г.). Перемешивают смесь в течение 48 час прио40 С, По",ле первой фильтрации комплексное соединение промьвают к счспендкруют.515460 ЦНИИЛИ Заказ 1981/237 1 ирдж 576 11 од;шсное Филиал ППП "Патент", Г. Ужгород, ул. Проектная, 4 В следуопих раствора.;.1. Вопя 150 млБуферный раствор 1 о фатапри рЛ 62 150 мч2, ХУористый 1 атрий 5 молей/Упои рП 6,2 150 мчВода 150 млЛ. Бутерньй раствор фосфата 150 мпФермент, фиксировдуп,й ца носителе цел люлозь, сохраняется .: буферном растворефосфата при р" 1 6 р 2,"хтилиость комплехсногс соединения,пслу аного из 13 г модифицированной иеллюпозы, оценивается на 1000 ед. свободной бета-гапактсзидазы,Активность бета-Гдлдктозидазы определяется ее Гидрслизующкм дейсгвием на с - цл;1-;ОЬ 1 ил -беа - Ц - ГалдктОУцлрае 1 сзид (О.И, П, Г,), которое выявляет желтую окрас -ку в растьоре (О, И. П. Г.), вызванную вьделенным с-нитрофенолом, Измеряют количество гидрслизовднного 0.11. П, Г.возрастанием опгической плотности при 4,200 Л,При постояцнсм р 11 окраска це улзмеляется,11 дцосил 1 ксив ье отсчета пРИ р лзх 1 ичньухр 11, а активность фермента оп,;целяпи измерением исходной скорости р:.кили.П р и м е р 10, КомуДев .Ое сседицение сычужцый фермент-древ;.Инная цел;полоза.Стержень уо чатка кукурузы, содержац.ий около 801 целлюлозы и 15% лигнина,измеьчдст в зерна от 1,5 до 2,5 мм,50 г этих зерен помешаст и 18%-ньуйлрство; натрия, который перемешивают вте.нц.це 15 .лиц при обьчцой температуре,Затем зернд вьшеляют и хорошо промываютхолодной водой, Б конце 11 ромьвают 1 лметанола, затем 400 мл пиридица. Послеэтоо зерна переносяц, 800 мл пири - 1 инди пересцивдют. Затем туда наливают по0 л хлористого тионила В 1 еенце 45 .Ин, Температуд реакционнойсреды повышается до 55 С, и среда внезапно сильно окрашивается, Спустя 1 чдспосле введеция хлористого тионила смесьВьливают в ванну ледяной воды. Затем зерна выделяют и промывают несколькими литрами воды, раствором хлористого водородапрп р 1 2 до полного удаления пиридинадбссрбировдцногс на зернах. Заканчиваютиром ьку 1 л метанола. Получецые зернассуцат при 40 С,Обработанная целлюлоза содержит .".,5%серы и только следы хлора,В 160 мл буферного раствора с фосфаГдхи 1 ри р 11 6,2 ВВОдят 16 Г зерен, цэи уе.;о.;:.:.:,.ньгл ,а 1,-1 азано выше, и 40 млого .,"а,- МЕта.ИЗВЕСТНОГО ПОД Маркой(;лил ллем ". Все вместе выдер -. 0живают при 40 С в течение 24 час приперемецуивании. Затем выделяют зерна иприступают к дессрбции жмически нефик -сированногс сьучужного фермента, Для этоГо промьвают сначала 2. мл ТОГО жебуферцого раствсра (как указано выше),Г,-Т, 2 т ; летЛИлооц;-цнг,й ВОДЬ И В КОН250 мл б,+ерногс раствора ацетата.-,11 В 11 -;. 4, .:" 1 ":11,:;е :;. створы этих 06 работок снова испо;ьзущт. Зерна комплексного соедиа с., -;жцй фермент-целлюлоза из с 1 ержця початка кукурузы сохра -няют при 4 С ь 2 "0 мл буферного раствора ацетата, Эгоомплексое соединениедадо отличнье результаты при свертываниимолока (8 г соединения, содержацего 0,04 гфиксированногс сьучужсго фермента, свернули ури непрерывнюй Операции 35 л молока за ".з ч,;.;, " ласси вским свертываниемс разба,-1 ением сьУчужОГО фермента В молоке это же количество позволяст свертывать только 0,4 ; , - .Фермент; фиксированные на твердомносителе а соответствии с изобретением,сохраняют о е., долгое время (до 2 лет)ферментативнус;,тивность, если их подвергать лиофилизаци и ранить при низкойЗО температуре.Ф о р м у л а н;-. о б р е т е н и я1, Сс;о. Уолучеи",." Мрмента, фиксированного цд Твердом,о,:теле, путем дисцергирования целлюлозы в буферном растворе фермента при рН 5.0-1 О,О и темпердтурЕ 0-45 С С ПОСЛЕдуеа,ИМ СтдЕЛЕНИ -ем целлюлозы с фиксирова:.ньум ферментоми ее про ывксл, .о т и и и а ю щ и й -с я тем, что, с це.ью услъчения болееактивных и стойких ферментов, используютцеллолозу, содерждуую в своей молекуледо 7% серы в виде окислов и или до 4%хлора причем при использовании целлюлозы, содержащей серу и хлор, содержаниехлора в молекуле целлюлозы ниже содержания серы,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю -уц и й с я тем, что целлюлоза содержит5-25 вес, % лигнипа, диспергированнсгов ее массе,Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе;65 1, Патент Франции И 2073902 от01,10,71,