Способ получения антибиотика

Гщ 5 ПО 27 ОП ИСАЙ ИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Своз Советских Социалистических Республик(о 1) М. 2) Приоритет 12.08.69 (31) 8493 Государственный комите Совета Министров ССС ло делам изобретенийи открытий(43) Опсбликован степь М 14 валия описания 29.09.7 а опубли Авторыизобретения Иностранцы Горман, Калвин Юджин Хиггена 71) Заявител Иностранная Эли Лилли эндрмампаи ИБИОТИ 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИ 1 Лзобретенимы шл ен ности. 1112нс-(сн,), - С- юн 1 00не качестве источ е вещества, как из семян хлоп экстракты, каздлочтительными мука, смеси ам,и з м,инеральных ика азота в соевая му атника, мя еин, смеси являются о,иислот. солей испо среду вводят а, кукуруза, ной или соеаминокислот. пептоны, соетакимукавый вая льзуют соли носится к медицлнскои лрогде К - Н или ОСНз, в литературе не описан, Он заключается в том, что культуру Ягер 1 огпусез сац 11 дегцз ХЕК 3585 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и,минеральные соли с:последующим .выделением целевого продукта в виде основания или соли,известковыми приемами.Выращивание осуществляют лри 25 - 37 С в течение 36 - 72 ч.В качестве источникака углерода в питательную среду вводят таиие вещества как,крахмал, глюкозу, глицерин, мелассу, декстрин. Предпочтительными являются глюкоза и глицерин. Предлагаемый сиосоо получения антибиояка общей формулы ОООНнатрия,калия, аммония,кальция, соединения фосфора, сульфаты и карбонаты.В среду целесообразно включать 1 и стимуляторы роста, Первоначальное значение рН среды должно быть 6,5 - 7,2.Культивирование Ягер 1 отлусез с 1 а цИяегцэ 3585 осуществляют поверхностным или глубинным способом в аэробных условиях.Инокулировапие среды осуществляют суспеизией спор или культурой в вегетативной форуме.Вегетативную форму посевного материала получают на той же среде, которую используют для культивирования.Выращивание культуры осуществляют при 25 - 37 С, предпочтительно прои 26 - 30 С в течение 36 - 72 ч при расходе воздуха в среду 0,2 - 0,4 об),иин на 1 объем питательноц среды, предпочтительно 0,4 об (мин.После выращивания культуры в течеиие ех дней антибиотик выделяют из среды. Для этого мслцелий и нерастворимые твердые25 15 Р4 (неорганическая соль - крахмальный30 ага) 15 Р5 (глице.рпчо-аспарпшовыи агар) 35 Томатная паста - агар с овсянои х 1) кой 40 Агар Эгиеосона Агар Беннета45 Агар Чапека 50 Глюкозо.аспаргпновый агарСкули ы й рост. Тироизиповый агар Питательный60 агар Я блоч но-к пельшкальции65 вещества отфильтровывают или центрифугируют, а из фильтрата или фугата антибиотики выделяют методом э 1 кстракции или адсорбции.Для адсорбции,используют такие адсорбецтыкак уголь, силикагель, окись алюминия, микрокристалличеокую целлюлозу или ионнообменные смолы.Адсорбированный антибиотик или его соль элюируют растворителем, При использовании в,качестве растворителя муравьинокислого аммония или ацетата натрия антибиотик выделяется в виде аммиачной или иатриевой соли.Микроорганизм Ягер 1 огпусез с 1 амг 111 дегцз ,выделяют из образцов верхнего слоя почвы при суспендировании их в стерильной дистиллированной воде с последующим распределевием суспеизий на агаре. После посева на агар культуру выдерживают при 25 - 35 С в течение нескольких дней. В,конце инкубационного, периода колонии микроорганизма, вырабать 1 вающего аитибиотик А 16886, дереносят стерильной платиновой петлей в косой агар. Затем его выдерживают в термостате до образования колоний для,посева в количестве, достаточном для получения антибиотика А6886.Использованный актиомицей трудно классифицировать в роде Ягер 1 огпусез ввиду не типичной, морфологии. По этой причине микроорганизм считается новой разновидностью и получил название Ягер 1 огпусеэ с 1 ауц 1 дегцз.Этот вид образует хорошо развитый мицелий из коротких симпоидально разветвленных воздушных пиф. Образуются булавовидцые боковые ветви со спорами от одной до четырех в .каждой. Конидии,в субстрате не оор азуются.Методом электронной микрографии были обнаружены споры с гладкими стенками. Препараты клеточной стенки содержат 1.-изомер диаминопимелиновой кислоты и глицин, кроме основных составных частей, аспаргиновой и глутамицовой кислоты и аланина. В массе споры серого цвета, а первичный мицелий окрашен от светло-желтого до желтовато-коричневых тонов. Растворимый пигмент не образуется. Оптимальная температура 26 - 30 С. При 37 С роста нет, По морфологии эта культура похожа на некоторые штаммы Т 11 еппогпопозрога и М 1 спогпопозрога,Новый микроорганизм хранится в коллекции культур службы агричсультурных исследований министерства сельского хозяйства США, Пеория, штат Иллинойс, 61604: под У РР 3585. Характеристика Ягер 1 огпусез с 1 а ц 1 дегцв 3585 дана в приведенных ниже таблицах.В таблицах цифры в скобках озчачают се- ри 1 И цветков Треснера и Бакуса, а также цветовые группы Моерца и Пауле и подчеркнуты табличные обозначения цвета. Спорофоры получены па воздушноммицечпп и состоят из сети коротких симиопдальпо разветвленных гпф.Ооычпо па коротких булавообразных ветвях образуется 1 - 4 споры. Размеры спор 0,34 - 0,85 ) 0,85 -1,5 мкм. Средние размеры спор 0,6.1,5 мкм.На электронных микрограммах впд.иы гладкостеишяе споры. Споры не образуются в мицсл пи субстрата. Рост обильный, серовато-желтый(11 С), зпачптельнлый воздушный мицелий белого цгета (Г) в (27 Л 1); растворимый пигмент отс тств ет. Обильный рост, серовато. желтая( Е 4); умеренный воздушньш мпцелпш, светлый, серовато-оливковгяй (ОМ, 1 - /и (21 В 1); растворимыйй пигмент отс тств ет.(1112); обильный воздушный мицелпй, темный, серовато-зеленый %х 24 - 6 1 ч (23 АЗ); растворимый пигмент отсмтствмет. Умеренный рост, светлый желтовато-зелеиый (10 В); хороший воз.ду 1 пный мпцелпй ч) Ь (27 Л 1); растворимый пигмент отсутствует. Учеренньш рост, светло-желтый (10 В 2); умеренньш воздушный мицелий, желтовато. серый (61) 2 дс (1 ОЛ 2); растворимый пигмент отс тств ет. Хороший рост, светлый, желтоватозеленый (1 ОВ 1); разбросанный воздушный мицелий, бепый; растворимый пигмент отсутствует.Обильный рост, светлый; желтоватозеленый (10 Л 1); хороший воздушный мицелий, белый (%) а.511027 Продолжение твблихы Наблюдавшиеся свойстваМолоко Нит заты Желатин Не восстанавливает., Не разж жает. Реакция роста на изменение рНПсптоно-железныйагар и триптонлрожжсвой экстрактОптимальная тем-пература Не происходит. При температуре 26 - 30 С хороший рост и спорообразование, при 37 С и выше рост не происходит.1.,1 - лиамииопимелиновая кислота, глицин, глутамииовая кислота, аспаргиновая кислота, алания и лейции,Основные компоненты гидролизатд целых клеток. Таблица 2Утилизация углерода 1 ЧЙР 1.3585 Соелиненсие Реакция роста Утглизация, глерола:1 АрдбпноздРамнозафруктоза О-КсилозаМелезитозаРафииозаДскстрозаЦелобиозаЛальтозаСахарозаЦеллюлозаИнозитМанитГлутаминат натрия 50(+) (+) 55 Как указывалось выше, антибиотик А 16886 можно получать,при выращиваниями )Х)КК 1 3585. В,качестве тлитательной среды для получения антибиотиха А 16886 можно,иопользовать различные среды, однако микроорганизм способен иопользовать только немногие источники углерада,в искусственных условиях выращивания, Специалистам в этой области известно, что микроорганизмы в сложной среде могут иопользовать такие источники углеро 60 65 т Не свертывает, происходит ссветлеиис перез 17 дней. рН 5,0 - 6,0 оптимальный прслсл для роста; при рН 7,5 - 8,5 происходит рост, но споры не образуются. В табл. 2 показаны результаты опытов по утилизации углерода, проведенных на организме 1 мКК 1. 3585. В таблице применены следующие обозначения;+ - Рост и утилизация-- Рост и утилизация не происходят (+) Вероятная утилизация( - ) Сомнительная утилизация. 10 15 20 25 30 35 40 45 да, которые в цскусственных условиях не используются. Для экономически выгодного получения махсимального выхода антибиотика Л 16886 и легкого выделения его предпочтительно использовать простые питательныесреды, такие как крахмал глюхозы, глялцерин,мелассу, дехстрин и т. п,При культивировании Ягер 1 огпусез с)а ц 11 оегцз ооразуются новые ангибиолозичесхцезсщестза, названные ависорами Л 168861 иЛ 1688611 или факторами 1 или 11. Соли э:нхантибиотиков легко получаюгся при реакцииих с соотзетствующими кислотауи или основаниями. Антибиотиках А 16886 и его соли обладают спосоаностью разрушать бактерцц, атахже глистогонным действием.Способ получения антибиопика Л 16886предусматривает выращивание Ягер 1 огпусезс 1 амц 111 дегиз мКК 1. 3585 в питателыойл среде,содержащей усвояемые источциии углерода,азота и неорганичесжих солей, в аэробных условиях глубинным методом до накопления впитательной среде значительного количестваатиби отика.Лнтибиотическое вещество Л 168861 представляет собой первичлую амманиевую соль -аморфное, вещество не совсем белого цвета,температура размягчения которого 190 -300 С. С повышением температуры изменяетцзет до темцо-коричневого. Легко растворимв воде, мало растворим в низших алканолах инерастворим в ацетонитриле. Вещество амфотерное и имеющее титруемые группы рК=41;рК = 5,2; рК= 9,3; рК. = 10,5, Молекулярный зес его равен, примерно 530. Примерный состав, %. углерод 40,26, водород 5,81,азот 33,37, кислород 7,2. Удельное вращение - (а)зд+ 153,6 (С = 1%,зесобъем вволе).Смесь его с минеральным маслом имеетследующие характерные полосы поглощенияицфрахрасноЙ ооласти споктра: 3,10; 5,68;6,30; 6,60; 7,20; 7,60; 8,33; 9,35; 9,60; 9,85;11,60; 12,90 як.и.Антибиотическое вещество Л 1688611 представляет собой аммиачную соль - пушистоеаморфное зещество, не совсем белого цвета стемпературой размягчения 190 - 300 С, с изненением цвета до темно-коричневого, Хорошо растворим в воде. Малорастворим в низших алкаволах и церастворим з ацетоцитрцле. Зто вещество амфотерное и имеет титруемые ГРУппы РК а 4 0 РК а 5 31 РК а 9 рК, = 10,5. Мол.,вес 526. Хи,мичесхийл состав,вес. %: углерод 41,01; водород 5,64, азот 15,75, кислород 29,28, сера 7,04. Удельное вращение (а) Р + 86,2 (С = 1% вес,объем в воле). Смесь его с минеральным гмаслам имеет следующие характерные полосы поглощения з инфракра."ной ооласти спехтра: 3,15; 5,70;6,30; 7,22; 7,64; 9,05; 9,40; 9,65; 11,60 лкль Содержание фактора 1 в ангибиотике 16886 составляет 1 - 99%, а фактора 11 - 99 - 1%. Примеси составляют 1%, поэтому они не были идентифицированы.15 55 При проведении качественного анализа смеси моноаммиачной соли фактора 1 и 11 дали положительные результаты с нингидрином, по Пан-Дутшеру, Бенедикту, Молиту, Фелингу, с дансилхлоридом, йодом, хлоридосм железа. Отрицательные результаты были получены с биуретом и реагентом Сакагуши. Смесь моно- аммиачных солей факторов 1 и 11, высушенных при,комнатной температуре в вакууме над безводным хлоридом кальция в течение 15 ч, обладала способностью вращать плссюсть лоляризации (сс) св + 110,1 (С = 1% вес/объем в воде). Смесь моноаммиачных солей факторов 1 и 11 стабильча при рН 3 - 8 и температуре 6 С в течение 8 дней. Относительно стабильна при рН 3 - 8, температуре 25 С в течение 2 дней, Биологическая активность смеси медленно терялась при рН 3 - 8 и температуре 25 С. Наполовину активность уменьшалась через 4 дня.Элементарный анализ моноамииачных солей А 168861, высушенных в вакууме над,пятиокнсью фосфора,:при температуре 80 С по:казал, что эта соль содержит 5,02% метоксила. Присутствие,метоксильной группы подтвердилось синглетом прои 3,53 мг/л спектра ядерно-магнитного резонанса. При спределении методом Ван-Слойка установили, что моноаммиачпая соль фактора 1 содержит 5,3% азота амина. По спектру ядерно-магнитного резонанса для фактора 1 в 020 установили следующие характеристики: 5,19 мг/л (1 Н, синглет); 4,94, 4,74 мгсл (2 Н, АВ квартет, /= 13 Гсс); 4,0 - :4,2 мг/л (1 Н, мультиплет);3,68, 3,32 мг/л (2 Н, АВ квартет, 1= 18 Гсс);3,53 мг/л. (ЗН, синглет); 2,6 - 2,4 мг/л (2 Н, мультиплет); 2,1 - 1,6 4 сг/л (4 Н, мультиплет),На спектре поглощения в ультрафиолетовой области антибиотика А 168861 в водном растворе видны максимумы поглощения при 242 лскм (Е ";, = 132) и п ри 264 лсклс (Е ";, = 165); измеряли также гкруговой дихроизм в водном растворе и установлен положительный эффект Коттона при 263 лклс и отрицательный эффект Коттона при 236 мклс.При хроматографиями на бумаге аммиачной соли антибиотнка А 168861 (с,применением бумаги Ватман1) получили значение Яс = 0,41 в системе растворителя пропанол - ацетонитрил - вода при объемном отношении1:1:1.Биоавтографы были получены при помещении хроматограммы,на агаровые пластиночки, на которые был посеян Ба 1 спопеа дапагигп в качестве испытуемого микроорганизма.При хроматографии в тонком слое антибиотика на силикагелевых пластинках в 70%-ном водном ацетонитриле с опрыскивачием нингидрином в качестве индикатора, Р; =- 0,51; на целлюлозных пластинках в системе ацетонитрилизопропанол - вода К =0,36.Аминокислотный анализ антиоиотика А 168861, проведенный по методу Спакмана - Мура и Штейна, показал два пика, соответст 20 25 зо 35 40 45 50 55 60 вусощие реакции нингидрина; один из них элюировали идентично глицином (0,61 млсоль/ мг), другой элюировали непосредственно перед применением глицина и иденпифицировалси как а-аминоадипиновую кислоту (1,97 лмоль/лг),При электросметрическом титровании моноаимиачной соли антибиотика А 1688611 в 66% ном,водном растворе дчгметилформамида лри значении рН 7,7 установили присутствие четырех титруемых групп: рК = 4,4; рК= = 5,7; рК,з = 9,6 и рК = 10,4.При значении рН равном 6,8 получили соответстзующие значения рК= 4,0; рК = 5,3; рК, = 9,2; рК = 10,5,Анализ фактора 11 в системе ядерно-магнитного резонанса показал отсутствие сигналов, характерных метаксильпых групп в дротивоположность фактору 1.Спектр ядерного мапнитно-резонанса А 1688611 в 0,0 дал следующие характеристики: 5,75 мг/л (1 Н, дублет, 1=5 Гсс); 5,15 мг/л (1 Н, дублет, 1=5 Гсс); 4,90 - 4,68 лг/л (2 Н, АВ квартет, / = 13 Гсс); 3,9 - 3,7 лсг/л (Н, мультиплет); 3,69 - 3,39 лсг/л (2 Н, АВ квартет, / = 18 Гс 4); 2,6 - 2,3 (2 Н, мультиплет);2,1 - 1,5 (4 Н, мультиплет),При анализе методом Ваи-Слайка у:тано- вили, что в антибиотике А 168861 :сдержится 5,1% азота.Ультрафиолетовый .спектр поглощения антибиотика А 1688611 в,водном растворе дока. зал максимум поглощения при 260 лклс (Е,","= 148). При измерении кругового дихроизма в водном растворе установили положительный эффект Коттона при 258 лскм и отрицательный эффект при 228 лссг 4 с.В результате хроматографии па бумаге (ватман1) фактора 11,получилчс значение Яс = 0,33 в системе растворителя пропапол - ацетонитрил - вода, при объемном отноше 4 сии 1: 1: 1. Биоавтографы получили при помещении бумажной хроматографии,на агаровые пластинки, засеянные Яагпопеи дапагцгп в качестве испытуемого организма.При хроматографии в тонком, слое моноаммиачной соли антибиотика па силикагелевых пластинках в 70%-ном водном ацетонитриле с опрыскиванием ппнгидрипом получили значение Я; = 0,42; на целлюлозных пластинках в системе ацетонитрил: изопропанол: вода = =1:1:1, Кс=029,Аминокислотный анализ кислого гидролизата антибиотика методом Спакмана - Мура - Штейна обнаружили в начале только один пик, соответствующий реакции нипгидрпна, его элюировали непосред:твенно перед пр имен.нием глицина и идентифицировали как гс-аминоадипинсвую кислоту (2,1 ммоль/ лг), Однако имелись также другие маленькие пики, которые элюировали глицином. Следующий образец анализировали таином же методом и установили величину 2,1 ялсоль/сиг и 0,13 лс иоль/лсг соответственно.0,82 0,82 Хроматография в тонком слое Лцетонитрил - вода (7: 3) на целлголозных пластин- ках 0,35 0,29 5,0 Исследования моноаммиачной соли антибиотияса методами хроматографии на бумаге и хроматографии в тонком слое в разных системах растворителя дали следующие результаты,Система растворителя Значения Р,Хроматографии на бумаге Фактор 1 ) Фактор 1 Антибиотик и его соли задерживают рост жак грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.Прекращение роста микроорганизмов лри минимальной концентрации наблюдалось з течение примерно 24 ч.Антибиотик и его соли пригодны для борьбы с:инфенсцией. Оии обладают активностью в отношении оа:стерийпатогенных для растении. П р ги м е р 1. Приготовление антибиотика5 во встряхиваемых склянках.Культуру Ягер 1 огпусез с 1 ас ц 1 оегцз 3585в форме спор выращивают на твердом косомагаре, имеющем следующий состав, г: ДекстринДрожжевый экстракт Ггндролизованный,казеин(Н - У типа ами,на Афирмы Шеффилд Кэмикал Компани)Мясной экстрактАгар Меера (промытый трижды)Де,снизированная вода Добавлением гидроопвиси натрия уста;азливают рН среды 7,0. Выращивание осуществляют в течение 4 - 6 дней при 30 С. 1 мл выра щенной культуры вводят в виде водной суспечзии в 100 мл вегетативной среды при рН 6,7 следующего состава, г: ГлюкозаСоевая лукаТвердые веществавымоченной нсукурузь 1Карбонат кальцияХлорид натрияДеионизированная вода,Вегетативный посевой материал встряхивают в течение 24 - 28 ч при 30 С, при одновременном вращении аппарата со окорость 1 о 40 108 облин. На 100 мл приготовленной средысостава, г: Соевая мукаКазеинНитрат натрияГликозный сироп (50%глеокозы)Водопроводная вода, л 50 предварительно стерилизованной при 120 С втвчение 30 мин, помещенной в,колбе Эрлен- мейера емисостью 500 мл, высевают полученный 5%-ный вегетатнвпый посевной материал, после чего солбу,встряхивают в течение 55 48 - 72 ч при одновременном вращениями аппарата со скоростью 250 об/мин, Во время брожения среду аэрируют стерильным воздухом при его расходе 0,4 об/мин,П ример 2. АнтиЬиотик получают чо примеру 1, используя среды следующего состава, гг Растворимые вещества отходов винокуренного завода65 (Нардисел)(Нутрисой 200 Д)Арахисовая мукаМеласса с патокойОвсяная мукаГлицеринВодопроводная вода,5,0 5,0 5,0 5,0 10,0 1,0 ГлицеринСахарозаЗерна соиЯнтарь ВУР 300Триптонцнофосфат казняВодопроводная вода,10,0 20,0 15,0 5,0 5,0 0,21 1 О л хлопчатника 20,0 10.,0 5,0 вода, л 1,0Мука из семянГлицеринГлюкозаВодопроводная 20,0 10,0 30,0 5,0 1125,0 125,0 500,0 187,0 125,0 2,0Гли церлинСоевый пептоннитрат,кальцияХлорцд натрияНадрисолВодопроводная вода,л 10,0 10 2,0 1,0 0,01 20,01 Пр,и мер 3. Антибиопик получают, как в примере 1, но используют следующую питательную среду, г: П р и м е р 4. Приуготовление антибиотикана среде следующего состава, г; ГгнокозаРастворимый крахмалПелтон Вильсона 159Гидролизованный казеян(Н - Х типа амина Афирмы Шеффилд КэмикалКомлани)Шестиводный сульфат магнияМеласса с патокойКарбонат натрияВодопроводная вода, мл П р и,м е р 5, Приготовление антибиотикана среде следующего, состава, г: Пр имер 6. На косой агар следующегосостава, г; ДекстринДрожжевой экстрактГидролизованный казеин(Н - Х типа амина А,Шеффилд КэмикалКомпании)Мясной экстрактШестиводный хлорид,кальцияАгар МеераДеиониэироваяная вода, л при рН 7,0 установленного с помощью гидроо)киси натрия, засевают культуру Ягер 1 отусез с 1 апд 11 дегцэ 3585 и выдерживают прн 30 С в течение 7 - 10 дней. Выращенную таклм образом культуру помещают в 2,0 мл стерильной бычьей сыворотки. Затем 1 мл полученной суспензия переносят в лиофиловую трубку и высушивают,при низкой температуре до образования таблеток. Полученные таблетки помещают на питательнуо среду следующего состава, г; при рН среды, установлечной гидроокисьюнатрия. 15 П р и м е р 7. Приготовление антибиотикана опытной установке,В бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 40 л,загрузили 24 л среды следующего состава, г:20 Антифом А (присадка,,препятствующая вспениванию, фирмы Дау Корвинг Компани)КрахмалНа,дрисолМукаГлицеринАмин АШестиводный сульфат железа Холодная водопроводнаявода, л Пер,зопачальное рН 5,9 доводят до 6,5 добавлением 20 мл 5 н. раствора гидроокиси натрия при 120 С и давлении 1,05 - 1,26 нг/см в течение 30 мин. На приготовленную таким образом среду высевают культуру, полученную по,примеру 6. Процесс брожения проте кает прои 30 С в течение 66 ч при аэрации стерильным воздухом, подаваемым со скоростью 0,35 объем/объем/мин и перемешивании механической мешалкой со скоростью вращения 420 об/мин. Конечное зпачение рН 6,3, 45 П р им е р 8. П,римерно 75 л бульона, полученного,по примеру 7, профильтравывают через Гифле Супер - Цел (диатомовая земля, выпускаемая в продажу фирмой Джонс - Манвилл Продактс), в количестве 5 г/100 мл.50 Фильтрат пропускают через колонну размером 9,5(130 см, наполненную 8 л угля (Питтсбург 12 Х 40), со скоростью 60 млlмин.,Колонну промывают 10 л деионизированной воды (рН 5,2) и 50%-ным,водным ацето ном. Полученные отдельные фракции объединяют и в вакууме отгоняют ацетон. Затем снова пропускают через колонну, наполненную дауэксом 1 - Х 1. Колонну промывают 10 л деионизированной воды и 0,1 М раство ром муравьинокислого аммония, Фракцииобъединяют и пропускают через колонну 9,5 х 100 см, наполненную углем, со скоростью 60 мл/мин. Колонну промывают водой и элюируют смесью ацетона я воды в отно шевии 1: 4 со скоростью 60 мл/мин.511027 13 общей 1 Н,Н С (,Н 2) 31СООН 1Ы О С БН р 50 Все фракции объединяют, концентрируют в вакууме, отгоняют ацетон и лиофилизируют.Затем 40 г лиофилизированных препаратов экстрагируют 4 л метанола при механическом перемешивании в течение 16 ч; нерастворимые в метаноле вещества отфильтровывают, а растворимую часть осаждают 5 объемами ацетона, Осадок отфильтровывают и высушивают. Выход 20,6 г.Этот препарат растворяют в мивимальном количестве воды и пропускают через колонну размером 5,8 х 120 лилнаполненную декстраном (Сефадекс С), со скоростью 1 ллмин. Затем элюируют деионизирозанной водой, фракции объединяют и лиофилизируют.Полученный продукт в количестве 10 г растворяют в 256 мл смеси ацетона с водой (55:45) и пропускают через колонну размером 5,5 Х 8,5 см, наполненную силикагелем, приготовленным в смвси ацетона,с водой (7: 3), Раствор пропускают через колонну со скоростью 3 мл(мин. Колонну элюируют смесью ацетон - вода (7: 3) со скоростью 5 млмин, Фракции объединяют, упаривают в ва,кууме досуха и лиофилизируют.Полученный продукт - смесь,моноаммонийиых солей фактора 1 и фагктора 11, и может быть использован для борьбы с глистами. П р и м е р 9. Выделен 1 ие факторов 1 и 11 антибиотика в форме моноаммонийной соли.Полученный препарат, описанный в примере 8, в количестве 10 г растворяют в 197 мл смеси ацетон - вода (55:45) и пропускают через, колонну размером 4,0 х 130 см, содержащую 1,6 л микро 1 кристаллической целлюло. зы (Авицел) в смеси ацетонитрил - вода (7:3). За ходом элюирования следят методом хроматографии на бумаге, В результате элюирования получают множество фракций, каждая из,которых содержит првимущественно один фактор, Фракции с соответствующими факторами объединяют и лиофилизируют.П р и м е р 1 О, Приготовление хлористоводородной соли антиб 1 иотика.Моноаммопийную соль антибиотика А 16886, полученную и,выделенную, как опигде К = Н или ОСНОВ,отл и ч ающи йся тем, что культуру Ягер 1 огпусез сас и 1 дегцз ГчКК 1. 3585 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением, целевого про 5 10 15 20 25 Зо 35 40 45 сано в предыдущих примерах, в количестве200 мг растворяют в 2 мл воды, Первоначальное значение рН 5,3 раствора доводят до 2,0прн дооавлении 1 н. соляной кислоты, а затем раствор упаризают досуха при пониженном давлении. После добавления 5 лл водыи 1,5 лл метанола хлористозодоролную сольосаждают добавлением 10 объемоз ацетона.Осажденный хлоргидрат антибиотика А 16886отфильтровываютпромывают и высушивают.Анализом установлено, что оп содержит4,50% хлора. При электрометрическом титровании продукта в 66%-ном растворе диметилформамида в воде при начальном значениирН 5,0 установили присутствие трех титруемых групп; рК=3,6; рК а. =5,2; рК а.,=10,8.П р и м е р 11. Приготовление динатриезойсоли антибиотика.Моноам монийную соль антибиотикаА 16886 з количестве 200 лггполученную ивыделенную, как описано в предыдущих примерах, растворяют,в 2 мл воды. Первоначальное значение рН 5,3 доводят до 10,5 добавлением 2,5 и, раствора гидроокиси натрия. Раствор упаривают в вакууме почти досуха, Затемдооавляют 1,5 мл метанола, соль осаждают 10объемами ацетона. Динатриевло соль антиоиотика выделяют путем фильтрования, промывают ацетоном и высушивают.Анализ показал наличие 6,73 Я, натрия.П р и м е р 12. Приготовление антибиотикав форме кислоты,Смесь моноаммопийной соли антибиотикаА 168861 и А 1688611 в количестве 20 лг растворяют в 40 мл воды. К раствору добавляют6 мл смолы Дауэкс 50 - Х 12 (Н+), перемешивают в течение 30 лин и профильтровывают через воронюку из среднеспекшегося стекла. Фильтрат (рН 2,65) лиофилизируют,При электрометрическогм ти вроваиии в66%-ном растворе дпметилформампда в воде,при лервоначальном значении рН 4,3, установили налпчиетрехтитруемых групп; рК=4,2;рК а, =56, рК, = 104. Формула изобретения1. Способ получения антибиотика формулы дукта в виде основания или соли известнымиприемами.2, Способ по и. 1, о т ли ч а ю щ,и йся тем,что выращивание осуществляют при 25 - 37 Св течение 36 - 72 ч.