Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН 3053 19) 114 С 12 И 15/О 12 Ц 1/ САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Е,ЬЙ 11:; ПАТЕНТ ом сэндОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(46) 15.11.89. Бюл, В 42 (71) Орион-Ихтюмя Ой (Р 1) (72) Аири Марьятта Палва, Туула Марьют Ранки и Ханс Эрик Седерлунд (1 (53) 575.224.2,547.2(088.8) (56) Патент США У 4486539, 436-504, 1984. Изобретение относитсной генетике и касается д ф ции вирусов и бактерий методвич-гибридизации.Белью изобретения является повышение чувствительности способа.Повышение чувствительности обнаружения бактерий СЫашуйа цитомегаловируса вируса простого герпеса, вируса папиломы человека, обеспечивается за счет использования серий чередующихся фрагментов нуклеиновых кислот, нанесенных на твердый носитель и меченных реагентов.П р и м е р 1. фрагменты ДНК, при годные для диагностики группы СЫашуЙха 1 гасЬошаГ.хв, приготавливают иэ ДНК СЫашуйа ггасЬошагдз серотипа Ь 2, Данную ДНК извлекают и фрагмен 1 тируют известными способами, получен(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦП 1 ВИРУСОВ ИБАКТЕРИЙ, ОСНОВАННЫЙ НА СЭНДВИЧ-ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ(57) Изобретение относится к молекулярной генетике и касается идентификации вирусов и бактерий методом сэндвич-гибридизации. Целью изобретенияявляется повышение чувствительностиспособа. Повышение чувствительностиобнаружения бактерий СЫашуйа цитомегаловируса, вируса простого герпеса, вируса папиломы человека обеспечивается за счет использования серийчередующихся фрагментов нуклеиновыхкислот, нанесенных на твердый носитель, и меченых реагентов, б табл,ные фрагменты ДНК клонируют в плазмиду рВВ 322 и переносят в организм хозяина ЕзсЬегсЬха со 1 д К 12 НВ 101 известными способами, В результате данного клонирования получают генныйбанк бактерий СЫашуйха гасЬошайзЬ 2, т.е получают большое число рекомбинантных плазмид, каждая из которых имеет раздельный ограничительный фрагмент Ваш Н 1 от ДНК хламидии,Для получения реагента из генногобанка отбирают рекомбинантные плаэмиды, содержащие максимально большиевставки ДНК, полученные от ДНК хладидий. Одну такую плазмиду обозначают рКТН 1220, которую сдали на хранение в Центр коллекций культур ВеигаспЯаппп 1 ппя акоп М 1 сгоогяапдзшеп под номером (0 БМ 2825), и пригодность которой для использования в качестве ре 1.523053агента демонстрируют способом прямой гибридизации. Испытание прказало, что рКТН 1220 идентифицирует все нуклеиновые кислоты от различных серотипов СЫашуйь.а ггасЬошаг.хз, но не идентифи 5 пирует никакие другие нуклеиновыекислоты.Фрагменты, полученные с использованием различньгх эндонуклеаз рестрикции, получают от ДНК плазмиды рКТН 1220 и некоторые из этих Фрагментов переносят при последующем клонировании в плазмиду рЛТ 153 и некоторые в фаг М 13. Фрагменты принадлежащие к серии в, используют как меченые пробы, В табл,1 приведены размеры этих фрагментов и векторов, используемых для последующего клонирования, названия рекомбинаитных плазмид и их использование,Фрагменты, приведенные в табл. 1,выделяют из агароэного геля методомэлектроэлюирования и клонируют в соответствующие сайты рестрикции векторов,25приведенных в табл. 1, используя дляэтого уже известные способы,Фрагмент ВашН 1-ВашН 1 2,1 кв получают следующим образом. Фрагменты ВашН 1 Ба 11 1,4 кв и Яа 1 1-Ваш Е Т 0,7 квплаэмиды рКТН 1220 разделяют гель электрофореза в агарозном геле,из которого их извлекают, Очищенные фрагментысвязывают друг с другом посредствомфермента Т 4 лигазы, и иэ ФрагментовДНК 2,1 кв, полученных в данной реакции, те которые имеют свободные концыВаш Н 1,.дополнительно связывают с ограничительной точкой Ваш Н 1 двойноймолекулярной нити Фаговой ДНК М 13шр 8.Таким образом получают рекомбинантный Фак-ДНК (шКТН 1245), содержащийДНК СЬ 1 атуд 1 а гасйошаг 1 э, включающуюдва раздельных фрагмента ДНК, которыене располагаются непосредственно рядом друг с другом в данном геноме.Однако в данном геноме их располагаютпо соседству с рКТН 1250 и рКТН 1254ДНК-реагентами, которые связаны сфильтром.Проводят исследование чувствительности ряда нуклеиновых кислот как реагентов в сравнении с непрерывной парой реагентов, используя способ сэндвич-гибридизации. Данное испытаниеосуществляют с использованием Фильт-4ров, каждьп 4 из которых содержит 10молекул как рКТН 1250 (а) так и рКТН 1252 (а 4) ДНК в виде одной молекулярной нити. Исследуемый образец представляет собой плазмиду рКТН 1220, которая в данном испытании вытягивается в одну нить при кипении в течение 5 мин в 0,17 М ИаОН, послеочего температуру снижают до О С и осуществляют нейтрализацию равномолярным количеством уксусной кислоты. В данном испытании используют нижеследующие пробы меченые 125, - перечисленные в табл. 1: тпКТН 1242 (Ь,), гпКТН 1239 (Ь ), шКТН 1248 (Ь ) и шКТН 1245 (Ъ, -Ь )Гибридизацию осуществляют при +65 С9 в течение 17 ч в растворе гибридизации, имеющим следующий состав. 4 х х ББ С, 0,02% Рсо 11, 0,02% поливинилпирролидона, О, 2% додедилсульфоната натрия (БОБ) и 200 мкг/мл ДНК спермы сельди. Фильтры промывают в течение 2 ч при 50 С промывочным раствором, имеющим следующий состав: 0,1 х ББС, 0,2% БОЯ, и осуществляют подсчет с использованием гамма-счетчика. Результаты приведены в табл. 2 и каждый результат представляет собой среднее значение пяти параллельных испытаний. Статистически рассчитывают,что 95%" допустимый предел испытаний, осуществляемых без образца (отрицательный контрольный), рассматривается как нижний предел позитивности. Эти значения составляют 52-54 отсч/мин, когда проба представляет собой ЪЬ или Ьз, 58 отсч/мин, когда проба представляет собой Ь 4 . Ь ; 5 б. отсч/мин, когда проба представляет собой Ъ -Ь, и б 5 отсч/мин, когда проба представляет собой(Ъ-Ь 1 ЬП р и м е р 2. Образцы, взятые от трех мужчин, страдающих уретритом, и от трех женщин, страдающих цервицитом, отбирают для испытания. СЫашус 1 а йгасЬошойз берут из мочеиспускательного канала мужчин, женские обраэць 4 берут из шейки матки женщин, Кроме того, прдводят исследование соответствующего числа аналогичных образцов пациентов, из которых хламидии не отбирают, Подвергаемые исследованию образцы отбирают с помощью тампонов с хлопковыми концами, которые погружают в буферный раствор с растворенным образцом хламидий, содержащий 0,2 М сахарозы, 20 мМ фосфатного буФера 3% сыворотки плода теленка,5 15230510 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ванкомицина и 25 ед/мл нистатина,Хламидии из данных образцов подвергают культивированию, Исходные образцы также анализируют посредством5сэндвич-гиб ридиз ации с ис поль зов аниемряда фрагментов нуклеиновых кислот.Данные образцы концентрируют с использованием 2-бутанола с целью удаленияиз них жидкости таким образом, чтобыконечный объем составлял примерно80 мкл, и таким образом концентрацияэтих образцов для испытания возрастает примерно в 3-7 раз. После этого вобразец вводят 70 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕРТА), 0,77 додецилсульфата натрия (ЯРБ), 20 мкг/млфермента К протеиназы и осуществляютобработку в течение 15 мин при 55 Си в течение 45 мин при 37 С. Послеэтого образец кипятят в течение 5 минв 0,175 М НаОН. Подвергнутый кипячению образец охлаждают до 0 С.и нейтрализуют равномолярным количеством25уксусной кислоты и подвергают испытанию. В испытании используют фильтрыв условии гибридизации, описанные впримере 1, Используемая проба представляет собой шКТН 1245 (Ь,-Ь),300000 отсч/мин 400 мкл раствора гибридизации,Результаты гибридизации представлены в табл. 3.Предел позитивности в данных испытаниях составляет 104 отсч/мин,Результаты, приведенные в табл. 3,показывают, что сэндвич-гибридизация,осуществляемая с использованием рядафрагментов нуклеиновых кислот, пригодна для диагноза венерических заболеваний. Образцы, которые были негативны при испытаниях культуры, былитакже негативны в испытании сэндвич. гибридизацией.45П р и м е р 3. Фрагменты ДНК,пригодной для диагностики цитомегаловируса, приготавливают из цитомегаловируса (АР 169, АТСС 7 К)-(СМ 7),ДНК выделяют и фрагментируют уже известными способами. Фрагмент 1 Е соКЕдлиной примерно 9 кв извлекают изагарозного геля путем электроэлюирования после того, как отделяют фрагменты ЕсоКЕ на основе их размера,Элюированную .ДНК экстрагируют фенолом, после чего ее осаждают этанолом,Очищенную таким образом ДНК связывают посредством Тлигазы с вектором 3 6плазмиды рВ 325, обработанным ЕсоКЕ ферментом, образующуюся рекомбинантную ДНК переносят в бактериального хозяина Е, со 1 х К 12 НВ 01. Из числа стойких к ампицилЛину и тетрациклину, но чувствительных к хлорамфениколу клонов выбирают такой, который содержит специфическую для цитомегаловируса вставку ДНК необходимого размера. Характер клонированной ДНК цитомегаловируса определяют методом нанесения пятен Боцг 1 тегп. Такоеиспытание показывает, что описанный фрагмент ЕсоКЕ-ДНК размером 9 кв получен от ДНК цитомегаловируса и, в частности, он включен в его фрагмент Нгпй 11 Е РОписанную рекомбинантную плазмиду обозначают как рКТН 1271 и сдают на хранение в Центр коллекции культур Рецйзс 1 те Яаппп 1 цпц топ М 1 сгоогдапвтпеп под номером РБМ 282 бПоследующие клонирования осуществляют уже известными способами с использованием в качестве векторов плазмиды рВ 322 и фагов М 13 тпр 7 и М 13 тпр 8, Ряд фрагментов нуклеиновых кислот приготавливают с использованием ограничительных фрагментов Е соКХ, Ватп НЕ, С 1 а Е и Рзг Е. В табл. 4 приведены размеры данных Фрагментов и векторы, используемые для дальнейшего клонирования, и даны названия образуемых таким путем рекомбинантных плазмид и их использование либо в качестве фильтр-реагентов, либо в качестве меченых пробИсследуют чувствительность ряда нуклеиновых кислот как реагентов в сравнении с непрерывной парой реагентов с использованием способа сэндвич- гибридизации, Образец для испытания в данном случае представляет собой ДНК СМ 7 (ДНК цитомегаловируса), который подвергают кипячению в 0,17 М НаОН в течение 5 мин и затем нейтрализуют, как и в примере 1, В данном испытании используют фильтры, каждый иэ которых содержит 10 молекул как рКТН 1273 (а,)ДНК, так и рКТН 1274 (а ) ДНК, в виде однониточной молекулы, й нижеследующие пробы, меченые 125, перечисленные в табл, 4: тКТН 1277 Й,) тпКТН 1 278 (Ь ) и ТН 1,279 (Ьз )Каждая из проб содержит 10 отсч/мин/мкгЭДНК, Гибридизацию осуществляют как описано в примере 1, Полученные результаты приведены в табл, 5.В данном испытании нижний пределпозитивности составляет 51-55 отсчетов/мин, когда проба представляетсобой ЬЬ или Ь 59 отсч/мин,когда проба представляет собой Ь, Ь51 ф Яи б 3 отсч/мин, когда проба представляет собой Ь ЬЬ,Результаты, приведенные в табл,5,показывают, что сэндвич-гибридизация,в которой используют индивидуальнуюпробу реагентЬ , Ь или Ь), вкаждом случае обнаруживает 4 х 10 б молекул ДНК СМ 7. С другой стороны гибридизация, осуществляемая с реагентом (Ь,Ь или Ъ,ЬЬз), обнаруживает лишь 10 молекул ДНК СМЧ. Данные результаты показывают, что ряднуклеиновых кислот, как реагентов, 20в четыре раза чувствительнее индивидуальных нуклеиновых кислот, как реагентов.Клинические образцы подвергают анализу путем сэндвич-гибридизации сиспользованием ряда реагентов. Этиобразцы включают два образца мочи,взятой у детей до одного годаЭтидети страдают врожденным большим эритроцитом (СМ 7). Данным способом сэндвич-гибридизации анализируют также образец, взятый путем биопсии легкого упациента с инфекционным легочным цитомегаловирусом (СМУ). В качестве образцов в данном испытании используюттакже зараженные и незараженные цитомегаловирусом клетки человеческогозародыша,В 10 мл образца мочи вводят раствор, содержащий 1 Е саркозила и 5 мМ40этилендиаминтетраук сусной кисло ты и200 мкг ДНК от зобной железы теленка,после чего ДНК, выделенную из вируса,вместе с носителем осаждают, используя 10 мл изопропанола, при комнатной температуре, Осажденную ДНК растворяют в 200 мкл буферного раствораТЕ и переводят в форму однониточноймолекулы путем кипячения в течение5 мин, после чего раствор ДНК охлаждают до 0 С и вводят в раствор гибо, 50ридизации.Образец биопсии легкого (несколькомм ) механически измельчают ножом ив него вводят 200 мкл буферного раствора ТЕ, содержащего 17.-ного раствора додецилсульфата натрия (ВРЯ) и1 мг/мл фермента К протеиназы, Вываривание осуществляют в течение 1 ч при +37 С, после чего образец проопускают дважды в шприц для инъекциичерез тонкую подкожную иглу, Гомогенизированный таким путем образец подвергают кипячению, после чего еговводят в испытываемый раствор,Зараженные цитомегаловирусом клетки и незараженные клетки разрушаютпод действием додецилсульфата натрияи К протеиназы, гомогенизируют иподвергают кипячению, как указано выше.Реагенты в испытании гибридизациейпредставляют собой рКТН 1273 (а) ирКТН 1274 (а ) на фильтрах и пъКТН 1277(Ь), тКТН 1278 (Ь, ), тКТН 1279 (Ь, )вкачестве проб, каждый 200000 отсч/минна реакцию. В других случаях гибридизацию, промывку и отсчет результатовосуществляют как описано в примере 1,Результаты данной гибридизацииприведены в табл, б.Результаты, представленны в табл,б,показывают, что используя ряд нуклеиновых кислот как реагентов, можнообнаружить цитомегаловирус с различных клинических образцах, таких какмоча, образцы биопсии легкого и клетки,Данное испытание специфично дляцитомегаловируса, оно не идентифицирует ДНК человека, т,е. данному испытанию не препятствует ДНК человека,присутствующая в испытываемом образце, Фактически тип образца не влияетна специфичность данного испытания,Формула изобретенияСпособ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот, включающий контактирование пробы нуклеиновой кислоты с первым фрагментом нуклеиновой кислоты, нанесенным на твердый носитель реагентом, и вторым фрагментом нуклеиновой кислоты, меченым реагентом, с последующим радиоактивным анализом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, при идентификации бактерий рода СЬ 1 ашуйха берут две серии чередующихся фрагментов нуклеиновой кислоты, причем в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют фрагменты С 1 а 1- Яа 1размером 3,0 кв и Яа 1 1 - С 1 а 1 размером 2,9 кв плазмиды рКТН 1220, субклонированные в векторе рАТ 153,1523053 Т а б л и ц а 1 Фрагмент Размер Вектор Рекомбинатная плазмида Использо.вание рАТ 153 рКТН 1252 рАТ 153 рКТН 1250 М 13 шр 8 шКТН 1242 М 13 шр 8 шКТН 1239 М 18 шр 8 шКТН 1248 М 13 шр 8 шКТН 1245 аС 1 а 1-Я а 11а Яа 1 1 -С 1 а 1Ь, Яа 11-ВаптН 1Ь ВашН 1-Яа 1Ь С 1 а 1-С 1 а 1Ь -Ь ВашН 1-ВашН 1 3,0 кв 2,9 кв О, кв 1,4 кв 1,7 кв 2,1 кв Фильтр Фильтр Меченая Меченая Меченая Меченая проба проба проба проба а мечеными реагентами являются фрагменты Ба 1 1 - Ватп Н 1 размером 0,7 кв, Ващ Н 1 - Ба 1 размером 1,4 кв и С 1 а 1 - Са 1 размером 1,7 кв плазмиды рКТН 1220, субклонированные в Фаг М 13 щр 8, причем Фрагменты Ба 1 Ватп Н и Ватп Н 1 - Ба 1 сшиты между собой с образованием фрагмента Ващ Н 1 Ватп Н 1 размером 2,1 кв, при идентификации цитомегаловируса в качестве нанесенных на носитель реагентов используют фрагменты ЕсоК 1 - Ря 1 размером 3,3 кв и Са 1 - Ващ Н размером 3,0 кв плазмиды рКТН 1271, субклонированные в вектор рВК 322, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент Ря 1 - РяС 1 размером О, 6 кв плазмиды рКНТ 1271, субклонированный в плазмиду М 13 щр 7, и фрагменты Ря 1 - Са 1 размером 1,0 кв и Ващ Н 1- ЕсоК 1 размером 1,0 кв плазмиды рКТН 1271, субклонированные в фаг М 13 щр 8, при идентификации вирусов простого герпеса типа 1 в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют два фрагмента ЕсоК 1-Ря 1 размером 1,1 кв и два фрагмента РяТ 1- Ващ Н размером 1,5 кв плаэмиды рКТН 1359 субклонированных в фаги М 13 щр 10 и М 13 щр 11, а в качестве меченых реагентов используют Фрагмент Нпт 111 - ЕсоК 1 размером 1,9 кв плазмиды рКТН 1359, субклонированный в плазмиду рВК 325, фрагменты Ря 1 1- Ря 1 1 размером 1,8 кв и Ндпс 1 111 - Ващ Н 135 размером 1,3 кв плазмиды рКТН 1359, субклонированные в плазмиду рВК 322,и три идентификации вирусов простого-.ерпеса типа 2 в качестве реагентов,нанесенных на твердый носитель, используют два Фрагмента Нтпт 111-РяС 1размером 2,0 кв и два Фрагмента Ря 1 Нтпт 111 размером 1,2 кв плаэмидырКТН 1351, субклонированные в фагиМ 13 тпр 10 и М 13 щр 11, а в качестве меченых реагентов используют фрагментРя 1 - Ря 1 1 размером 5,7 кв плазмиды рКТН 1351, субклонгрованный в плаэмиду рВК 322, и при дополнительнойидентификации вируса папиломы человека типа 11-ЧПВ 11 в качестве реагентов нанесенных на твердый носитель,используют два фрагмента Ващ Н 1-Ря 1 1размером 1,4 кв, два фрагмента Рвах 1 Ряе 1 размером 0,8 кв и два Фрагмента Ря 1 - РяС 1 размером 0,9 кв генома ЧПВ 11, субклонированные в фагиМ 13 шр 10 и М 13 щр 11, а в качествемеченых реагентов используют два фрагмента РвС 1 - РяС 1 размером 1,7 кви 1,5 кв генома вируса папиломы человека типа 11, субклонированные вплазмиду рВК 322, и при идентификации вируса папиломы человека типа 16в качестве реагентов, нанесенных натвердый носитель, используют по двафрагмента Ряе 1 - Ря 1 размером1,7 кв и 1,1 кв генома ЧПВ 16, субклонированные в Фаг М 13 шр 10, а в качестве меченых реагентов используютфрагментВатп Н - Ря 1 размером2,7 кв и 0,5 кв генома вируса пагиломы человека типа 16, субклонированные в плазмиду рВГ, 322.(Ь-Ъ ) Ь, 380000 340000 350000 310000 700000 00000 Таблица 3 Гибридизиро- Результаты ванная радио развития активность хламидий Образец 30-55 419 Таблица 4 Ограничительный фрагмент РВВ 322 рВБ 322 М 13 шр 7 М 13 шр 8 М 13 шр 8 рКТН 1273 рКТН 1274 шКТН 1277 шКТН 1278 шКТН 1279 Фильтр Фильтр Меченая проба Меченая проба Меченая проба Мужчина 1211311411511611Женщина 121131141111611Буферныйраствор, .Х СЫ. егасЬошайя2 Бактерии,1 О а ЕсоВ 1-Ря 11 (3,3 кв) а с 1 а 1-ВашН 1 (3,0 кв) Ь, Ря 1-Ря 11 (0,6 кв) Ь Ря 11-с 3.а 1 (1,0 кв) з 151 164 15461 76 55 343 509 362 57 58 81 Вектор Название Использование14 13 1523053 Т а б л и ц а 5 Гибридизированная радиоактивность с использованием (Ь) в качестве пробы Образец Ь Ь Ь д 2 Ь Ь Ь молекул/испытание 0104 10б7 отсч/мин/испытание;отсч/мин/испытание;отсч/мин/испытание;отсч/мин/каждого испытания; отсч/мин каждого испытания.Таблица 6 Гибридизированная Выделе- радиоактивность ние ви- руса Образец Зараженныеклетки (10 )Моча 1(10 мл)Моча от 3521 243 3215 Цитоме- галовирусНе дано 68 65 Не дано разца Составитель НКузенковаРедактор А. Долннич Техред Л.Сердюкова Корректор О.Ципле Заказ 6985/59 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 310000 Ь 320000 Ьэ 300000 Ь Ь 3 ООООО Ь, Ь Ь 300000 здоровогопациента(1 О мл)Образецбиопсии легкогоКонтрольные клетки 10Нет об 3533 38 38 44 46 85 135 142 203 254 265 4595205415 Не даноЦитомегаловирусЦитомегаловирусНе дано 53125292645
СмотретьЗаявка
3856877, 15.02.1985
Орион-Ихтюмя Ой
АИРИ МАРЬЯТТА ПАЛВА, ТУУЛА МАРЬЮТ РАНКИ, ХАНС ЭРИК СЕДЕРЛУНД
МПК / Метки
МПК: C12N 15/00, C12Q 1/02
Метки: бактерий, вирусов, идентификации, кислот, нуклеиновых, основанный, сэндвич-гибридизации
Опубликовано: 15.11.1989
Код ссылки
<a href="https://patents.su/7-1523053-sposob-identifikacii-virusov-i-bakterijj-osnovannyjj-na-sehndvich-gibridizacii-nukleinovykh-kislot.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот</a>