Способ получения содержащего фруктозу продукта из сахарозы

)4 С 071 3/О ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ПАТЕНТУ рейга оГес 1 дггоп, 4. НапйЬоьоп РгоЫ- озелчегГ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) КегК-ОгЬшег. Епсус 1 осйеппса 1 гесЬпо 1 оцу гЬгйч. 4, Б Л 1973, с. 543-54о 1 с ог Бцяагз, зесопс 1 Ейд 1егГгез о 2 1 пчегГ апй зцсгБо 1 цггопз. Р,. 81-83, 1976(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОДЕРЖАШГО ФРУКТОЗУ ПРОДУКТА ИЗ САХАРОЗЫ,включающий обработку сахарозы ферментом при температуре 58 С и рН 5 с получением смеси, содержащеи декстрозу и фруктозу, о т л и ч а ю - ш и й с я тем, что, с целью повышения содержания фруктозы в целевом продукте, сахарозу обрабатывают фрук тозилтрансферазным ферментом Йпц 1 озцсгазе 2,4.1.9 с получением продукта, содержащего декстрозу, фруктозу и полисахариды, содержащие не менее бб мас.7 фруктозильных остатков, при чем фруктозильные. остатки связаны (2 1) Р -связью с последующей последовательной обработкой изомеразным ферментом, иммобилизованным нао.пористой окиси алюминия, при 60 С и рН 8,4 и инвертазным ферментом в течение 2-6 сут или кислотой, такой как соляная или серная, в течение 1 ч и в отсутствие активного изомеразного фермента.Изобретение относится к способуполучени продукта, содержащегофруктоэу из сахарозы, который находитприменение в пищевой и фармацевтической промышленности.Цепь изобретения - повышение содержания фруктозы в целевом продукте.Предлагаемый способ обеспечиваетполучение фруктовых сиропов, содержащих более 55% Фруктозы.Приготовление 1 является иллюстрацией типичной процедуры ферментации, проводимой с целью полученияжелаемого фермента из штамма дрожжейрц 11 ц 1 ага рц 11 ц 1 апэ АТСС 9348,Получение ферментного препаратаФруктоэилтрансферразы на целитном носителе, Процедура ферментации, используемая для продуцирования укаэанного Фермента,Среда, используемая для развитияпосевной культуры (инокулята) и дляферментации с целью продуцированияжелаемого Фермента, имеет следующийсостав,%. "дигидрофосфат калия 0,5;хлористый натрий 0,1; гептагидратсерно-кислого магния 0,02; сульфатаммония 0,06; дрожжевой экстракт(производства ФирмыДифко Лабораториз) 0,3; сахароза (пищевого сорта) 7,5. рН среды доводят до 6,8. 102030 Посевные колбы (500-миллилитровые колбы Эрлемейера, содержащие100 мл стерильной среды указанного 35состава) засевают исходной культуройчерных дрожжей рц 11 ц 1 аг 1 а ри 11 и 1 апэна скошенном агаре. Для этой целииспользуют штаммы этих дрожжей, который обозначен в каталоге под названием "Коллекция типовых культур США"(Роквилл, Мэриленд, Атег 1.сап ТуреСпегцге со 11 есгхоп) как штаммАТСС 9348, Эти посевные колбы (послевыдерживания их на качалке возвратнопоступательного типа в течение 48 чпри 32 С) используют для инокуляции1-литровых эрленмейеровских ферментационных колб, каждая из которых содержит 200 мл среды указанного состана. При этом .используют концентрацио посевного материала (инокулята),равную 0,5% (масса/объем). Ферментацию провоцят на качалке возвратнопос.упательного типа в течение 7 дн. 55(при 32 СИзвлечение фермента из ферментациОНОГО буьона,Ферментационные бульоны иэ сорока 1-литровых встряхиваемых на качалке колб объединяют вместе, освободившиеся колбы ополаскивают водой и эти промывные воды тоже присоединяют к объединенному Ферментационному бульону, Конечный объем бульона после разбавления составляет 12 л. Первоначальный объем ферментационного бульона ранен приблизительно 8 л, 12 л ферментационного бульона пропускают через непрерывную центрифугу типа "шарплес" с целью удаления дрожжевых клеток и клеточных остатков. К полученному супернатанту, который представляет собой черный вязкий раствор, прибавляют затем хлористый кальций до концентрации 0,5% (масса/ объем) и рН полученного раствора доводят до 7,0 с помощью гидроокиси натрия, Затем эту систему вторично пропускают через центрифугу типа шарплес", получая в итоге вязкий супернатант, имеющий незначительную по интенсивности окраску, Величину рН этого обесцвеченного супернатанта до:водят соляной кислотой до 5,5 и затем вносят 1000 ед. пуллюланазы. Получаемый при этом бульон консервируют с помощью толуола (добавляемого до насыщения) и пуллюланазу оставляют реагировать при температуре окружающей среды на ночь. После Ферментолиза пуллкланазой в течение ночи в бульоне суспендируют 1% (т,е. достаточное для образования суспензии 1%-ной концентрации) целита "Графко У 503, Сгегсо 9 503 Се 1 дге" производства фирмы "Дзонс Манвилл Продактс Корпорейшн", Ломпок, Калифорния и затем добавляют туда же 2 объема (24 л) ацетона, При этом образуется осадок, который собирают фильтрованием, Фильтр-прессную лепешку промывают на фильтре ацетоном и сушат при температуре окружающей среды. Собранный на фильтре осадок (Фильтр-прессиая лепешка) содержитпереведенный в нераст-(, воримое состояние (иммобилизованный) фермент фруктоэилтрансферразу. В приготовлении 1 следует обратить внимание на то, что прибавление хлористого кальция к ферментационному бульону и доведение рН бульона до 7,0 приводит к удалению черного пигмента и присутствующих в бульоне кислых полисахаридов.Благодаря указанной обработке целевой ферментный продукт получаетсяв виде сравнительно чистого бесцветного препарата, С помощью этого метода обеспечивают целевой ферментныйпрепарат, не содержащий нежелательныйпигмент и кислые полисахариды, которые образуются в качестве побочныхпродуктов в процессе ферментации и,если их не удалить своевременно, со Оосаждаются с ферментом при добавлении к ферментационному бульону растворителя (ацетона),В качестве дополнительной мерыочистки при выделении очищенных ферментных препаратов желательно удалить из ферментационного бульонапуллюлановый полисахарид, неизбежноприсутствуюший в нем, вследствие того, что этот полисахарид тоже будет 20соосаждаться с ферментом фруктозилтрансферразой при добавлении растворителя к ферментационному бульону.Поэтому супернатант, полученный в результате обработки ферментационного 25бульона хлористым кальцием и доведения рН до 7,0 гидроокисью натрия,может быть подвергнут дополнительнойобработке известным гидролизующимферментом пуллюланазой. Фермент пуллюланаза беспоряцочно гидролизуетпуллюлан с образованием низкомолекулярного полимера, что позволяет избежать соосаждения и, как следствиеэтого, загрязнения ферментного пре 35парата фруктозилтрансферразы в процессе обработки бульона органическимрастворителем (например, ацетоном,этиловым спиртом и т.д.).Фруктозилтрансферразные ферментные препараты могут быть использованы и без удаления пуллюлана.Э к с п е р и м е н т 1. Получение вторичного субстрата при исполь-.зовании фермента фруктозилтрансферразы на пуллюлановом носителе. К 207.-ному раствору сахарозы, забуференному 0,05 М цитратным буфером с рН 5,5 прибавляют 1 мас.7. сухого пуллюлана, полученного в соот О ветствии с методикой приготовления 1 с той разницей, что пуллюлан не гидролизуют пуллюланазой, а оставляют в системе качестве носителя фермента фруктозилтрансферразы. По этой причине 55 не используют целит, который вносят в бульон после его обработки пуллюланазой в качестве носителя в примере 1, Активность ферментного препарата фруктозилтрансферразы, полученного в соответствии с такой видоизмененной методикой, составляет 677 една 1 г пуллюлана. Реакцию проводятпри температуре окружающей среды дотех пор, пока смесь не помутнеет.Образец этого материала анализируютс помощью жидкостной хроматографиивысокого давления и получают в итогеследующие результаты.Углеводный (сахаридный) составсмеси, вычисленный по результатаманализа методом жидкостной хроматографии высокого давления,Е: фруктоза 6,9; декстроза 40,6; ДР 6,2;ДР 11,1; ДР 35,2.ДР означает степень полимеризацииполисахарида.Эксперимент 2 дополнительно характеризует фермент. полученный согласноприготовлению 1,Э к с п е р и м е н т 2, Эксперимент 1 относится с трансфруктозилазации с использованием первичногосубстрата, в котором содержание сухого вещества исходной сахарозы непревышает точку насыщения при данныхусловиях реакции. Эксперимент 2 показывает использование первичного субстрата с начальной концентрацией сахарозы выше насьлцения, который подвоздействием фермента фруктозилтрансферразы дает продукт, содержащий повышенные уровни материала ДРь (т.е,фруктозилсахарозы) и пониженную концентрацию продуктов ДР . Кроме того,показано увеличение койцентрации сухого вещества (в мас, отношении).вто.ричного субстрата по сравнению сконцентрацией сухого вещества, полученного при отсутствии ферментовфруктозилтрансферразы. Кроме того,показано, что с понижением концентрации сухого вещества полимера фруктозы во вторичном субстрате материал ДР, присутствует в незначительныхколичествах. Это отличается от результатов эксперимента 1 с исполь зованием субстратов сахарозы на уровне ниже точки насыщения В этих примерах ДР является первичным продуктом,Приготовление вторичного субстрата из шламов сахарозы выше точки насыщенияя,Пищевую сахарозу в виде 200 г аликвот помещают в 1-пинтовые склян"1230469 надосадочной жидкости удаляют из каждой склянки и помещают в испытательной колбе с завинчивающейся пробкой в ванну с кипящей вацой для инактивации фермента. Затем зти образцы анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и определяют сухое вещество в надосадочной жидкости (способ Фишера).10 Результаты исследований представлены в табл. 1,Т а блица 1Фермент -Сухоевещество Состав карбогидратов в растворе при использовании жидкостной хроматогра - фии высокого давления, 7 СахаС 1 лян- ка роза,гв надо-,ные садочной еди- ницы ДРстроза,Фрук- Декжидкос- тоза ти, массовоесоотношение н,о,80,9 0,6 72,7 0,7 14,5 668 62,6 1,0 15,7 0,9 13 23,1 24,1 10 200 900 79,0 25,0 3,7 25,4 4,1 200 1000 79,6 10 Не об- Не об 99,7 наружено наружено наружено мобилизованную глюкозоизомеразу, которую иммобилизуют по следующей методике.Носитель из пористой окиси алюминия дважды промывают водой и при перемешивании инкубируют в течение 1 ч с О,", М цитратом натрия, который вымывают иэ носителя до тех пор,ки с завинчивающейся пробкой. В качестве контроля в одну склянку добавляют 50 мл воды, а в другие50 мл воды, содержащей увеличивающиеся количества фермента фруктозилтрансферразы - препарат "Селит" (получен согласно приготовлению 1).Каждую склянку закрывают пробкой ипомещают во встряхиваемую водянуюванну при 54-55 С. Склянки встряхивают в течение 24 ч при периодическом ручном перемешивании. Образец 200 100 74,5 200 200 75,6 200 300 76,3 200 400 77,1 200 500 77,7 200 600 78,1 200 700 78,1 200 800 80,Контроль 200 Нет 72,7 Хотя в вксперименте 2 использовалось 200 г сахарозы на,50 мл воды, т.е. 80 мас,7-ное соотношение, концентрация сухого вещества исходного вещества сахарозы может быть увеличена.В примерахи 2 при изомеризации ,декстрозы во фруктозу используют им 17,3 58,5 8,0 56,0 18,8 53,8 19,3 522 19,9 50,0 20,6 48,6 Не об 13,7 0,7 16,6 1,1 19,0 1,8 21,0 2,1 21,9 2,8Углеводы йпп 1 озц,ксилозосгазе изомера.4.1.9 зой5.3.1.5 инвертазой дополнительно в в течение нотечение6 дн. чи 62,4 фруктоза 2,4Лекстроза 32,8 41,9 15,7 29,4 36,2 18,9 1,9 10,6 11,0 0,5 12,9 22,9 22,9 0,9 13,9 32,5 31,3 Г 1 Р пока проводимость промывных вод недостигнет 1000 мкОм . Носитель инкубируют с 0,05 М хлоридом магния втечение 1 ч, после чего раствор хлорида магния декантируют.Добавляют такой объем 0,05 М хлорида. магния, чтобы получить результирующую концентрацию фермента, равную400 ед./мл, Концентрат глюкозоиэомеразы (ксилозоизомераза 5,3.1.5),полученный с помощью 81 герСотпхсезо 1 уосЬгошо 8 епез АТС 21715, прибавляют к носителю в концентрации14 мл. ед. на 1 ф (около 28,4 х 10 см ).Носитель и фермент выдерживают вконтакте 22-24 ч, после чего несвязавшийся фермент отмывают с носителядистиллированной водой.Полученный таким образом иммобилизованный фермент загружают в стеклянную колонку с рубашкой (Зх 18 см),снабженную насосом, соединенным сподающим питающим резервуаром. Основной объем колонки после загрузкиравен 45 мл,П р и м е р 1. Сахарозу пищевойчистоты (600 г), растворяют в водедо общего объема 800 мл, рН этогораствора доводят до 5,5 с помощьюразбавленной хлористоводородной кислоты, Сухую рецептуру цеолитфермент(йпи 1 озцсгазе 2.4.1.9), 11 г, имеющую активность 550 ед(г и полученную согласно эксперименту 1, суспендируют в 100 мл воды. Суспензию отфильтровывают под вакуумом на воронкеБюхнера с использованием фильтра иэбумаги ватман Р 1. Осадок на фильтредополнительно промывают 100 мл воды.После этого 200 мл фильтрата прибавляют к раствору сахарозы, которыйпомещают в сосуд емкостью 1,89 л,снабженный завинчивающейся крышкой.10 Затем сосуд помешают в водяную баню стемпературой 58 С и проводят реакциюв течение 20 ч. Реакционный продуктсодержит смесь декстрозы, фруктозыи полисахаридов, содержащих не менее 15 чем 66 мас.Е фруктозильных остатков,причем фруктозильные остатки связаны(2 - -1)-связью.Состав углеводов следующий,Я:фруктоза 2,4, декстроза 32,8;20 ДР 10,6; ДР 22,9; ДР, 31,3.После этого к продукту реакцииприбавляют хлорид магния концентрацией 5 ммоль/л и рН доводят до 8,4добавлением разбавленного раствора 25 гидроокиси натрия. Затем эту смесьподвергают действию глюкозоизомеразы(ксилозоизомераза 5.3.1.5), иммобилизованной на пористой окиси алюминия в колонке (иммобилизованную изо меразу получают по указанной методике) нри 60 С и рН 8,4, Определяют углеводный" состав продукта, собранного из колонки.Данные представлены в табл. 2.1230469 Анализ состава, мас,7,Углеводы после обработкис 1 пцТояиспосле обработки после реакции с серной кислотой ксилози -зомеразой5.3,1,5 через через 1 ч про ч проведения ведения гаяе2.4,1.9 реакции реакции труктоза 2,4 15,7 60,359,1 32,8 Декстроза 18,9 38,7 37,9 10,6 11,0 1,9 2,6 22,9 22,9 04 0,3 31,3 0,2 После этого продукт подвергают действию очищенного инвертазного фермента, полученного из СапйЫа п 1;1 хя при соотношении 1 О мг фермента на 100 мл продукта, и проводят реакцию в течение ночи при комнатной температуре, Образец продукта анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления, а с оставшимся продуктом проводят реакцию еще 10 в течение 6 дн. после анализа. Конечный продукт содержит 62,4 Е фруктозы, в то время как обычная инверсия сахарозы обработкой инвертазным ферментом дает продукт, содержащий 15 50% фруктозы,П р и м е р 2, Сахарозу пищевой чистоты (600 г) растворяют в воде с получением общего объема 800 мл, 2 Ц рН этого раствора доводят до 55 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты, Сухую рецептуру цеолитфермент (ЫЫояцсгаяе 2.4.1.9),. 11 г, 1имеющую активность 550. ед/г и полученную по эксперименту 1, суспендируют в 100 мл воды, Суспензию отФильтровывают под вакуумом на воронке Бюхнера с использованием Фильтра из бумаги ватман 9 1. Осадок на 30 фильтре дополнительно промывают в 100 мл водь, После этого 200 мл фильтрата прибавляют к раствору саха- розы, находящемуся в сосуде емкостью 1,89 л с завинчивающейся крышкой. За-з тем сосуд помешают в водяную баню с температурой 58 С и проводят реакциюв течение 20 ч, Продукт реакции содержит смесь декстрозы, Фруктозы иполисахаридов, содержащих по крайнеймере 66 мас.7. Фруктозильных остатков,причем фруктозильные остатки связаны (2- - +1) 13 -связями. Определяютсостав реакционного продукта.Затем в реакционный продукт прибавляют хлорид магния в концентрации5 ммоль/л, рН доводят до 8,4 добавлением разбавленного раствора гидроокиси натрия. Затем эту смесь подвергают действию глюкозоизомеразы(ксилозоизомераза 5.8,1.5), иммобилизованной на пористой окиси алюминия в колонке (иммобилизованнуюизомеразу получают по указанной метоцике) при температуре 60 С ирН 3,4 Определяют углеводный составпродукта собранного из колонки,К этому процукту прибавляют сернуюкислоту концентрацией 0,05 н, Смесьнагревают до 75-80 С и проводят реакцию в течение 2 ч. Через - ч про 1ведения реакции отбирают образцы ипровоят их анализ на углеводныйсостав с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Результирующий продукт содержит приблизительно 607 фруктозы. Обычйая инверсиясахарозы обработкой инвертазным ферментом дает продукт, соцержащий 507Фруктозы,Результаты исследований представлены в табл. 3,Таблица 32 230469 Составитель Г, КонноваТехред Л. Сердюкова Корректор, И. Эрдейи Редактор А, Коэориэ Заказ 2463/60 Тираж 343 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5.Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 11 1П р и м е р 3. Продукт, полученный после обработки ксилозоизомеразой 5,3.1.5 по примеру 1, подвергают гидролизу инвертазой полученной из РГапяеЮ 1 ЕаЬогагог 1 еэ, 1 аМеяап, 111 йпо 1.з) с использованием 0,1 мл инвертазы на 10 мл раствора. Гидролиз для фруктозы и глюкозы завершают через 48 ч. П р и м е р 4, Продукт, полученный после обработки ксилоэоизомеразой 5.3.1.5 по примеру 2, подвергают гидролизу разбавленной соляной кислотой при 70 - 80 С. Гидролиз для фруктозы и глюкозы завершают приблизительно через ,1 ч.