Способ получения 1, 2-5, 6-диангидро-3, 4-бис-( карбоксипропионил)-дульцита или его динатриевой соли

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИН ПАТЕНТУ Ргф "СЩРи, Ц Н.1;(71) Хиноин Дьедьсер еш ВедьесетиТермекек Дьяра РТ (НП)(72) Илона Элекеш, Ласло Инштиториш,Кальман Медзихрадски, Ласло Втвеш,Хедвиг Медзихрадски, Каталин ди Глериа,Янош Шугар, Жужанна Шомфаи-Релле,Шандор Экхардт, Иван Хидии Шандор Керпель-Фрониуш (Нц)(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1,2-5,6 - ДИАНГИДРО - 3, 4-БИС - ( Р-КАРБОКСИПРОПИОНИЛ)-ДУЛЬЦИТА ИЛИ ЕГО ДИНАТРИЕВОЙСОЛИ, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что 1,2-5,6-диангидродульцит подвергают взаимодействию с ангидридомянтарной кислоты в сухом этилацетатев присутствии пиридина при 45 С, целевой продукт выделяют в свободномили в виде динатриевой соли, 1225487Пес бГ;Рте;ие Относится к сгтосОб т Пстсту . т,я НОВЫХ ХИМИЧЕСКИХ бИОЛОГИ- Ч:СН;т : ТИВЬтс СОЕДИНЕНИЙ КОВКРЕт" но к сттс собу голучетия новых производных :.:,гидрсьс 1 ульцита,2-5,6-диангщ.", в .",4-бцс-(р-карбоксипропионил) - ту 11,1 та или его динатриевой соли, осалакпис св особностъю ингибировать развитие злокачественных Опухолей,Цел-, - , изобретения - получение ноВых произ 1;одньтх ряда 1, 2-5, 6-диангцтсрог;у;т 1.,та, обладающих более высоким -еряпевти.теским индексом при более :-":якой токсичности.П р ц м е р 1, 1,46 г (10 ммопь)1,2-56-диангидродульцита растворяют1 в 20 тсухоо этилацетата добавляют с ряс:твору 5 мл пиридина, а затемк смес : малыми порциями добавляют2,0 г (20 ммоль) янтарного атггидрида при постоянном перемешиваниИ, Смесь подогревают до 45 С и перемещиватотт тти этот те 1 пературе в течение еще8 ч. Растворцтель дистиллирук 1 т в ватсууте остаток отбирают в смеси этилапетата и Воды, полученную смесь ос:торожно подкисляют, охлаждая льдом,до рН т 1-5. Органтгческую Фазу отцеляют промыгают Водой, высушивают и Выс 1 р 5 н тют, 11 с)Гтучают 2,5 " твердого отта кь который соответствуь.т количественному Выходу, рассчитанному ДЛЯ МОНОСУКттИНИЛ - ДИЯНГИДРОДУ 1 тЬЦИТЯ.Псьггутенное сырое вещество подвергают .сттсттатогрдфированию на колонке с сцн ттгелем, используя смесь (1".1,обтьемттобъем) метанола и этилацетата в кячес.тве элоирующего агента. Фрак 1 РП,С тДЕР;СаЩИЕ ЧИСТЫЕ ПРОДУКТЫ, ПЕреме 1 твяют, раствор выпаривают в Вакууме. Полученный твердый продукт.ОДт Г,таОТ ПЕРЕКРИСтЯЛЛИЗаЦИИ ИЗ С твс,иятИЛОВОГО ЭФИра И ГЕтрОЛЕйЬ 1 ОГс =-ЛИРа а ЗатЕМ ИЗ СМЕСИ МЕтаНОЛа т,ссттз ТИЛО ВО ГО ЭФИраПОЛу"1 ЯЮТ 1,с11,2"5,6-циангидро"3,4-бис- -(Р-сярбоксипропионил)-дульцита,Вычислено, %: С 48,78; Н 5,73; О 4- 49Н От (346,29)Няилево-. /а. С 48,35, Ь 52 этО 46,60. Оквивале:.:.тная масса: Вычислено 173, ттайдЕНС 180,1 П.-спетсгр: 3350 см " (карбоксиль:,ая гтэуппа) . 1235 см(эпокси), бенЯИ 1 Ь 1 ЫЕ Н т ИДРОКСИПЬНЫЕ НОПОСЫ НЕ СтСт 1 ЫРт С 1 ЕНЫРЯСтГ ОРт 1;ЮСТ 1;: СОЕДИНЕНИЕ ХОРОШОрастворяется в спирте и ттрагидроФуране 1, сЯбо раст 10 римо Б диэтило -Вом эфире и ВодеП р и м е р 2,. Полуттение динатрий, 2-5, 6-диан гидрО-З, 4-б те- (д-карбоксипропионил) -дульцита 2 Н О.246,29 г (1 моль) 1,2-5,6-диангидро,4-бис-(Р- карбоксипропионил) -1 О дульцита растворяот в 3360,3 мл5%-ного (по Весу) бикарбоната натрияС НОСТОЯННЬЕМ НЕ)тЭМЕЯИВ Я КИЕМ ПРт 1 КОМнатной температуре до тех пор, покане прекратится образование двуокисиуглерода. Полученный раствор отфильтровывЯют и,т 1 иофичизую., Получают426,29 г (1 моль/100%) динатрий,2-5,6-дианттндро - 3,4-бис-(р-карбоксипропионил)-.дульцит 2 НО, В стабильном2 О негигросконичьтом (при комнатной температуре) Веществе установили числоколец, которое составляет 99%.БК-стэектр." 1725 см (сложныйэфирный карбонил), 1680 сы (кислот,15 ный кярбонил), Характерная для кислотных гидроксилов полоса в 3500-2800 см "отсутствует,Вычислено, %: С 39,447; Н 3,783,СттН ь О 1 т 1 а. 2 Н,ОНайдено%С 39 440 т Н 3780ПО 111 учеьпте соединения были подвергнуть Фармакологическим исследоВаниям,Оценены терапевтические свойства35следующих соединений:А = 1,2-56-11 иантгидро,4-диацетилдульцита (Дз, А С Д А Д) 4 В = 1,2 - 5.,6-циангидро,4 в бисв(р -карбометоксипропионил) -дульцита(Дз. 811 Д А Д);С=. 1,2-5, с 6-диангидро- ф-карбоксипропионил)-4-ацетилдульцита;5 О 0-5 = 1 2- 5,5 -диангидро-(тз.-карбоксипропионил)-4-(13-карбометоксипропионил,-дульцита;С-.6 = 1,2- 5,6-диа 1 глдро-("карбоссипропионил)-4-(В-Фенил пропионил)"цульцита.укаэанные соединеня, где А, В иС 11 влпотся диспожными эдтирами в3."т-псложзнцн 1,2"5,6-диангидро1225437 4 дульцита (Д А Д), не содержат никаких свободных карбоксильных групп. Соединения С, С, Си Стакже являются дисложными эфирами в 3,4-по. ложении Д А Д, но соединение Ссодержит две, а соединения С, Си Содну гидроксильную группу,Осуществлены следующие исследования: усвоение энзима;тест на токсичность;определение дозовой зависимости ингибирования роста опухоли, гематоксичности и летальных эффектов для близких соединений, полученной отдельно на одинаковых моделях;терапевтические индексы, полученные на различных твердых, способ- ных к трансплантации опухолях гры-зунов;ингибирование роста опухоли в твердой системе Саркома 180, влияние отдельной и повторяемых инъекций 3мутагенность.Усвоение энзима:Соединение В пытались превратить в соединение Сс помощью энзимного гидролиза при следующих условиях:время: 0,5: 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 24 0 ч;температура 37 С;буфер: 1/15 М фосфата;энзим: химотрипсин, трипсин, ацилаза 1, ацилазаОСогласно оценке при указанных условиях все сложно эфирные соединения В расщепляются с одинаковой скоростью. Следовательно, метиловый сложный эфир не может быть селективно разложен и трансформирован в кислотную форму. СН - О-, СОблизких к С, полученная отдельнона одинаковых моделях:метод: самцам крысы Ухзгог лекарства были введены через 24 ч послезаражения 2 х 10 клетками 1 УаТ 1 ег,Эффективность определяли па дозам,вызывающим 50-ное ингибированиеопухоли при взвешивании на десятыйдень. Дозы, приводящие к 507-номууменьшению гранулоцитов, оцененныхна четвертый день, служили в качествеоснов для сравнения гематоксичности.Отношение минимальной летальнойдозы -,(Ю ) к минимальной эффективной дозе (МВД = Е 1 ) рассматриваликак терапевтический индекс.Согласно данным табл. 2 соединениеСактивно против опухоли в такойже дозовой области, как производныеблизких по структуре соединений А, Ви С (1-Д 13 17 мкмоль/кг), в товремя, как соединение Сменее токсично (более чем в два раза), чемвсе другие вещества, указанные здесь.Следовательно, терапевтический индексСв два раза ролее предпочтителен,чем индекс любого другого членагруппы.Терапевтические индексы, получен 30ные на различных тверлых транспланхгтируемых опухолях грызунов, даныв табл. 3.Ингибирование роста опухоли втвердой системе:Саркома 180: влияние отдельной иповторяемых инъекций.Метод, небольшие образцы твердойСаркомы 180 были инокулированы накожу самца мыши Яьгзз. Интраперитональное применение лекарства к груп 40пе из шести животных начали на следующий день, на 11-й день опухоли былиудалены для.оценки,Данные отдельной и повторяемыхинъекций на ингибирование роста опу 45 холи в твердой системе Саркома 180приведены в табл. 4.Острая токсичность:В табл. 1 приведены данные острой токсичности. Найдено, что соединение Снаименее токсично из всех близких по структуре соединений как для мьппи, так и для крыс,Дозовая зависимость ингибирования роста опухоли, гематоксичности и летальных эФФектов для соединений,50 55 Отсутствие мутагенности соединения Св анализе Салмонелла/микро- сома:Все испытуемые производные алкилирующих сахарных спиртов за исключением С - 2 были мутагенны в штаммах ТА 1535 и ТА 100 по результатам анализа Салмонелла/микросома. Данные относительно мутагенных и токсичных эффектов 1,6-дибром-дульцита, 1,2- -5,6-диангидродульцита, 1-бром,5122 487 20 30 азгп .,родульц 1 та и 1, 2-эпок си, 6- -ацг цгодупьцита известны.Даже с. использованием микросомных, эцзьсол, полученных не только из печ ци крысы, цо также из легкого крысы, -очки мыши или печени хомяка, соед-,ение Сне проявляет мутаген,:ос гл .( штаммам ТА 1535 и ТА 100.Соединение Стакже не проявляет ь;у"а еццости к штаммам ТА 1357, ТЛ 1538 и ТЛ 98 в присутствии или о гсутс (в,;:е смеси 8-9, полученной из сза :., (Оь я в1.утагенцость соединений А и В поелг аллена в табл. 5 и 6. С; в .сцс эксперименту соединение Сказалось цемуТагенным. Это кя;:,:т -иуетс тем, что концентрация соо-ц 1 ецил Свплоть до 10 микро рд ,.;.;:., тинка це уменьшает числа ба(- г :. а 1 =,:-".ьг( кле гок, произрастающихг, (1 й среде,: ако соединение В вызывает 10- "-.(ратное увеличение числа бактерц зл-. цых клеток, произрастающих вцор алькой среде.С ,-( ггой стороны, соединение Вв ызь зос: 0-14-(рагное увеличениечисла ".еве 1".ац гцых пластинок, в то.-рс;: как высокая концентрация в10 (рограмм/пластина является С; г.асио сравнению токсикологичес.вармакологических данных, мута.,-е обдала:ат молекулы, це содержащиесвободных карбоксильных групп,Характеристические данные антиопуцелевой активности соединений А,В и С оцененные ца трансплантированных опухолях, являются существенно45менее предпочтительными по сравнениюс характеристическимиданными соединений С, С, Си С, содержащихсвободнуа карбоксильную группу.. Терапевтические индексы соединения В, содержащего двекарбометокгги,упгп, являются также менее предпочтительными по сравнению с такимиже свойствами соединений С, С,С" 5 ,:, С-б, Из этого можно предположит=., то карбометокси-пропионильная"ру;,г,а,. замещавшая 1,2-5,6-диангидро,.- р г ь, А Д) в 3 иили 4-м положениях не вызывает увеличения тс рапевтической активности, как ( воболныгкарбоксильные группы, замещающиеД А Д в таких же положениях,3. Отсутствие мутагецности в случае соединения С, содержащего свободные карбоксильные группы (в противоположность другим мутагенным производным бийуцкциональцого гексита,особенно соединения В, содержащегодве карбометокси-группы), показывает,что присутствие карбоксильцой группывносит существенные изменения в биологическую эффективность.Мутагенность соединений А и Впредставлена в табл. 6.Энзимная система живого органа не способна к трансформациисоединения В в соединение 0-2, содержащее свободную карбоксильцую группу.Следовательно, соединение Б це можетрассматриваться, как предшественниксоединения С. Это иллюстрируетсяне только существенным биологическим различием, но также включенными здесьрезультатами экспериментов по усвоению энзимов,5. Терапевтическая активностьсоединения А, содержащего две ацетильные группы, существенно ниже терапевтической активцости соединенияС, содержащего не только ацетиль"ную, но также и карбоксильцую группу,6. Соединение С, содержащее двефенилпропионильные группы, обладаетменее предпочтительной терапевтической активностью, чем соединение С,имеющее одну Р -фенилпропионильнуюи одну свободную карбоксильцую группы,7, Предпочтительный терапевтический индекс соединений С, С, С и Спроявляется в результате существенного уменьшения токсичности,которая связана с наличием свободныхкарбоксильных групп. Терапевтическийиндекс соединений С, С, СиСв 8-15 раз лучше, чем терапевтический индекс соединений А, В и С,что является неожиданным и непрогцозируемым для соединений подобнойструктуры. Небольшое изменение химической структуры принесло существенное изменение характеристик фармакологических свойств. Такое улучшение терапевтического индекса, осуществленное изменением одной группыв молекуле является неожиданным,непрогнозируемых и неочевидным.1225487 Таблица 1 Чродоолжение табл. 1 Лекарство ЕЛ для Ы длясамца мышикрысыБю 1 з з" УдзгогС235 126 С210 146 36 25,5 52 80 660 С190 С180 105 Таблица 2ИндексыбезопасностиЕД ., лимф/ЕД, И Токсич ИнгибиЛекарство Терапевтический индексо Лво Белые рованиеопухоли, импланность 1 о ф мг/кг гранулоциты кровиЕД 5 огран,мг/кг тированной поУа 1 сегЕЛ омг/кг 25,5 10 17 33 52 25 28 3,6 80 20 22 110 6,4 10 35 8,8 18 50 8,2 70 Терапевтический индекс, указанный в Декларации, относительносоединений А и С. С190 С105 С126 С-б 146 7 7,4 12,5 6,4 5,0 38 5,5 19 5,7 22 ЬЛ определяли на нормальных самцах мыши Яы 1 зз весом 27-31 г.После одной инъекции группа иэ шести мышей при одной дозе была прослежена в течение 21 дня." Ь 0 определяли на крысах ИзСогУа 1 сег, больных раком. Инъекции лекарства давали через 24 ч после трансплантации опухоли группе из шести крыс и вели наблюдения в течение 10 дней. Белыелимфо -цитыкровиЕД 5 олимф,мг/кг1225487 10 Таблица 3 180 х 8 Импланх 14 интр. ТЛ /ЕД "5 о Бо х 1 интраперитонально1 Р Ч/ЕЛ Лекарство Терапев- тический интр.МТД/ЕД индекс д/Едко 15,7 (13) 4,3 3-3,4 38 4,1 4 3 17Величины мадли цир ремя они был являются опубликованными, в т чет повторения экспериментов,скобка аны заТерапевтические и ексы также опубликованы Т а б ц а 5 о 50 екарст- Инъек- ЕД,МТЛ, о ция мг /к г мг /к ЕЛ 21 60 6,7400 16,4О 15,7,3 33 8,0 6,О 25 5 6,3 тирование по Иа 11 сег Щ, тя/ЕД Ы 5 60 2,9 53 Меланомах 14 интр.МТЛ/Ед".лб яяь Х)ляк печень" лег- почка печень печсн счснь сгк)с почл:а ПР)е)ь сч яь кое 277 17(15) 48 33 25 3 160 158 278 252 155 233 32 12(12) 41 27 28 19 171 137 249 213 140 10 185 28 13(17) ЗЗ 27 28 15 190 13330 19(14) 39 35 25 22 . 154 142 31 36(28) 42 51 32 43 180 171 100 213 1000 172 255 10000 Вепре рывно(спонтанно) 26 19(16) 44 36 24 17 149 150 250 251 165 214 Данные в скобках получены после прелнарительной чнкубации (Я-смесь ф бактерии + Сва исключениемверхней части агара) в течение 30 мин при 370,Таблица 6 Ревертаит/пластинка ТА 100 КонцентраЛекарство Гистидин ТА 1535