Способ получения растительного полимера-эпигалохина

(уо) (11) 18 К иуко А.Г ур Айзиков, яхарский го Красногомни растительныхУзбекский научноОН.В олек с мотликорни р25-707 щей обр дуо ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ордена ТрудовоЗнамени институт хивеществ АН УЗССР и(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО НОЛИИЕРА-ЭПИГАЛОХИНА Формулы равное 1-5,сой 7000-10000,й с я тем, чтокона экстрагируютспиртом с послекцентрированног елое число,улярной масч а в щ иодиолы Семеым зтиловымботкой ско1155601экстракта этилацетатом, высушиванием,нзмельчением экстракта в порошокс последующей ечисткой его от низко.молекулярных примесей трехкратным кнпяченнием с этилацетатом и высушиванием полученного порошка при темпера отуре 30-60 С н остаточном давлении 1-10 мм рт.ст. до постоянного веса. таоксифлаван: (-)-2,3-цис-(2 Й,ЗК) -., Формулы Изобретение относится к способу получения нового растительного полимера -(4,8), (4,6) (-)-2, З-цис-(2 К,ЗЙ)- -3,4-транс-(ЗР,4 Ь) -3,3,4,5,7-пене Однако этот снстадийиым, требуетоксических растви ацетона. об является снегиспользованияителей: метанола т я является способстительного полиноликатеяиив,Целью изобретениполучения нового р оль мера эпигвлояинвИ - целое число равное 1-5,с молекулярной массой 2000-10000,который проявляет противогипоксичекую активность и может найти применение в медицине.Эпигалохин является высокомолекулярным катехином,Известен способ получения поликхина-таннина экстракцией иэ корнейревеня ацетоном, затем экстракциесуммы таннинов из сырья метаноломи затем экстракцией из водно-метан ного экстракта этилацетатом, с последующим промыванием метанольногоэкстракта на хроматографической клонке с севдексом маркиН последовательно водой смесьюэтанола с водой (1: 1), этанолом исмыванием с колонки метанолом. Выхцелевого продукта 2,853 от весасырья 13, 3 11556обладающего противогипоксическойактивностью.11 ель достигается тем, что согласно предлагаемому способу корниРодиолы Семенова экстрагируют 25 ЦХ-ным этиловым спиртом с последующей обработкой сгущенного экстрактаэтилацетатом, высушиванием, измельчением экстракта в порошок с последующей очисткой его от низкомолекулярных примесей трехкратным кипячением с этилацетатом и сушкой полученного порошка при температуре/ о30-60 С и остаточном давлении1-10 мм рт.ст. до постоянного веса.Способ осуществляют следующимобразом.Воздушно-сухие измельченные корниродиолы Семенова при комнатной температуре экстрагируют 25-707-ным эти- щловым спиртом порциями, взятыми всоотношении к сырью 1:5-1:6 (весобъем) четыре- шестикратно, каждыйраз по 12-24 ч, Затем концентрированные в 30 раз упариванием в вакууЮме при 30-60 С объединенные экстракты пятикратно обрабатывают порциямиэтилацетатом, взятыми в соотношениик экстракту 1:0,4-1:1 (объем-объем)Этилацетатные фракции отделяют, очи- З 0щенный водно-спиртовый экстрактупаривают в вакууме при 30-60 С,остаток измельчают в порошоки повторно обрабатывают этилацетатомвзятым в соотношении к порошку1:1,5-1:3 (вес-объем), в колбе с об 35ратным холодильником на водяной банев течение 15 мин при кипячении. После охлаждении и отстаивания этилацетатный раствор сливают. Обработкупорошка этилацетатом повторяют 3 раза. Очищенный порошок высушиваютопри 30-60 С и остаточном давлении1-10 мм рт.ст. до постоянного веса.Выход целевого продукта 5-153 от веса воздушно-сухих корней, зависитот места сбора сырья и режима обработки (количества экстракции, крепости используемого для экстракцииспирта). Полученный эпигалохин представляет собой аморфный порошоксветло-коричневого цвета с характерным запахом, растворимый в воде,этаноле, метаноле, диметилформамиде,диметилсульфоксиде, разлагается. при 290-300 С ГФ 3 +40 (с 1,0, эта- ффЭнол) .При использовании для экстракцииэтилового спирта крепостью менее О 1 257. наряду с эпигалохином извлекаются гидроильные балластные вещества (моно- и полисахариды, минеральные соли и т.п,), что затрудняет очистку целевого продукта,Экстракция сырья этиловым спиртом крепостью вьппе 707. приводит кзначительному снижению выхода эпигалохина и увеличению содержания гидрофобных низкомолекулярных балластных веществ в экстракте.Предпочтительно использовать этиловый спирт концентрации 30-403.При получении целевого продукта эпигалохина упаривать и сушить ирак" тически возможно при любой температуре до 60 С. Температура в этих пределах практически не влияет на качество и количество получаемого целевого продукта, а лишь ускоряет процессы упаривания и сушки. Длительное воздействие на препарат темпеоратурой более 60 С приводит к ухудшению фармакологического действия препарата. Остаточное давление определяется температурой сушки.1П р и м е р 1. В.перколятор емкостью 20 л вносят 2000 г воздушно- сухих мелкоизмельченных корней родиолы Семенова и шестикратно экстрагируют при комнатной температуре смесью вода - этиловый спирт (253 по объему) порциями по 12, 10, 10, 10, 10, 10 л, каждой порцией в течение 24 ч. Полученные экстракты, хранящиеся в темноте при комнатнойтемпературе, объединяют и упаривают в роторном испарителе под ваку," умом (при остаточном давлении30 мм рт.ст., который обеспечиваетсяводоструйным насосом) при 40-50 СФдо 2 л. Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз но500 мл). Этилацетатные фракции выбрасывают. Экстракт упаривают на водяной бане в фарфоровых чашках. Остаток высушивают под вакуумом в сушильном шкафу (10 ми рт.ст., иасля", ный вакуумный насос) при 50-60 С и измельчают в порошок. Последний в колбе емкостью 1 л заливают этилацетатом (300 ип) и кипятят на водяной бане с обратныи холодильником в течение 15 иин. После охлаждения и отстаивания этилацетатный Раствор сливают. Обработку зтилацетатои пов. торяют 3 раза. Затеи порошок высушивают в сушильном вакуумном шкафувакуумом (30 мм рт.ст.) при 40-50 С до 2 л, Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз по 500 млХ Этилацетатные фракции выбрасывают. Экстракт упаривают на водяной бане в фарфоровых чашках, Остаток высушивают под вакуумом в сушильном шкафу (10 мм рт.ст.) при 50-60 С и измельчают в порошок. Последний в колбе емкостью 1 л заливают этилацетатом (300 мл) и кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 15 мин. После охлаждения и отстаивания этилацетатный раствор сливают. Обработку этилацетатом повторяют 3 раза. Затем порошок высушивают в сушильном вакуумном шкафу (1 мм рт.ст,) при 50-60 С до постоянного веса и изчезновения запаха этилацетатаЛолучают 100 г (57 от веса исходного сырья) эпигалохина (целевой продукт), представляющего собой аморфный порошок светло-коричневого цвета с ГМ 3 40(с 1,0, этанол), разлагающийся при 290-300 С, ИИ= =2000-10000.Эпигалохин является смесью растительных полимеров с различной степенью полимернэации, где 0 = 1-5 (примеры 1-3 получения пигалохина). Структура общей формулы,эпигалохина подтверждена химическими превращения ми и данными Уф-, ИК-спектров, сравнением этих данных с данными, полученными при изучении полимера с н, выделенного из самого эпигалохина еРазделение полимеров г 1 -2, И-З, Ине представляется возможным с технической точки зрения. Активность целевого продукта проявляется суммой конденсированных катехинов с различной степенью полимеризации - энигалохнномФОпределение молекулярной массы эпигалохина. Иолекуляриую массу (ИИ) устанавли" вают методом гель-Фильтрации на колонке с сефадексом марки Ь Н, растворитель и элюент - смесь диметил" Формамид " вода (9: 1). Образец берут в виде 0,5 Х"ного раствора в указанной смеси растворителей и наносят на колонку (143 см) с сефадексом. Скорость элюации 6"7 мп/ч, Фракции собирают по 1 мл, концентрацию вещества в них определяют на спектрофотометре СФпри 278 нм. 6 1155601(1 мм рт.ст.) при 50-60 С до постоянного веса и исчезновения запаха этилацетата. Получают 300 г (157 от веса исходного сырья) целевого продукта, представляющего собой аморфный порошок светло-коричневого цвета с ГО 3" +40 (с 1,0, этанол), разлагающийся нри 290-300 С, ИИ =б2000-10000,П р и и е р 2, В перколятор емкостью 20 л вносят 2000 г воздушносухих мелкоизмельченных корней родиолы Семенова и шестикратно экстрагируют при комнатной температуре20-25 смесью вода - этиловый спирт 15(357 но объему) порциями по 12, 10,10, 10, 10 л, каждой порцией в течение 24 ч. Полученные экстракты, хранящиеся в темноте при температуре20-25 С, объединяют и упаривают в 20роторном испарителе под вакуумом(30 мм рт,ст.) при 40-50 С до 2 л.Сгущенный экстракт обрабатываютэтилацетатом (5 раз по 500 мл), Этилацетатные фракции выбрасывают. Экстракт упаривают на водяной бане вфарфоровьх чашках, Остаток высушивают под вакуумом в сушильном шкафу(";О мм рт,ст.) при 50-60 С и измельчают в порошок. Последний в 39колбе емкостью 1 л заливают этилацетатом (300 мл) и кипятят на водяной бане с обратным холодильникомв течение 15 мин, После охлаждения иотстаивания этилацитатный раствор сли.Эвают. Обработку этилацетатом понто"ряют 3 раза. Затеи порошок высушиваютв сушильном вакуумном шкафу при50-60 С до постоянного веса и исчезновения запаха зтилацетата. Получают 200 г (1 ОХ от веса исходногосырья) эпигалохина (целевой продукт),представляющего собой аморфный повофшок светло-коричневого цвета с 0 Ц +40Э(с 1,0, этанол), разлагающийся при 4290-300 С, ИИ = 2000-10000.П р ц м е р 3. В перколятор емкостью 20 л вносят 2000 г воздушносухих мелкоизмельченных корней родиолы Семенова и шестикратно экстра-гируют при комнатной температуресмесью вода " этиловый спирт (703 пообъему) порциями по 12, 10, 10, 10,10, 10 л, каждой порцией в течение24 ч. Полученные экстракты, хранящиеся в темноте при комнатной температуре (20-25 С), объединяют иупаривают в роторном испарителе под1155601На гель-хроматограмме (элюограмме) целлюлозой (5 х 140 см, 400 г). Элюираэграничивают области димеров, три- руют водой, водным этанолом (1:1), меров, олигомеров и полимеров раз- этанолом, метанолом, собирая фрак- личной степени полимериэации. Под- ции по 20 мл.1-45 вода, 46-90 (восчитав площади этих фракций на 5 да-этанол), 91-134 (этанол), 135- элюограмме, установили, что соедине (метанол). Упариванием раствония с ММ меньше 2000, т,е. составляет рителя из Фракций 1-52 и 58-160 бот суммы соединения с ММ до получают соединения различной сте - 2,5 . 5100-5900 - 20%; 5900- пени полимеризации (в граммах): 6600 - 50%; 6600-7400 - 15 ;, по 10 0,61; 5,87; 14,53, 4,50,. 0,85; 052 10000 - 3,5% и более 10000 - З . процентное соотношение которых совИз элюограммы и подсчетов видно, падает с результатами, полученнычто основную часть суммы составляют ми гель-Фильтрацией. полимеры с ММ 5100-7400 (85 ). При сгущении фракций 52-57 выдеРасщепление эпигалохина. 15 ляют 1,72 г вещества состава Г- Н О,-96 75В четырехгорлую круглодонную кол- ММ 1947 (ультрацентрифуга), при бу емкостью 50 мл помещают 1,0 эпи-300 С разлагается, И 0,01 в галохина и 5,0 едкого калия. При системе И -бутанол - уксусная киспостоянном пропускании тока азота лота - вода (Зй 1:5) и К 10,54 в и перемешивании нижнюю часть колбы 20 этаноле Ы 3 +40 (с 1,0; этанол).М о погружают в баню с легкоплавким Вычислено%: С 59,16, Н 3,87; сплавом при 155-160 С. Температуру О 36,97.поднимают в течение 5 мин до 230 С Найдено%: С 59,17, Н 3,86, и затем реакционную смесь быстро О 36,97.охлаждают, подкисляют 202-ной сер УФ-спектр:215, 245 278ф ЯЩ(ной кислотой. Содержимое колбы раэ нм (1 д 5,43, 4,89, 4,45, 4,7) . бавляют водой и экстрагируют этил- Спектр снят на снетрофотометре ЕР- ацетатом (50 мл х 5 раз). Этил- ЗТ фирма "Н 1 асМ" (Япония). ацетатное извлечение сушат безвод- ИК-спектр:," 3500-3200, 2935, ным сульфатом натрия, Фильтруют ЗО1657 1610, 1535, 1515, 1495, 1440, и отгоняют. Остаток хроматографи, 1250, 1200, 1150, 1105, 1040, рувт на колонке с полиамидом 103883, 830, 800, 770, 737 см (элюент - смесь хлороформа с мета- Спектр снят на приборе ИРиолом 9: 1). Получают следующие соеди "Карл-цейс-Иена" (ГдР). нения: С,Н,О, М 126, т.п 7. 218- Молекулярная масса и гомогенОЭ 5219 С, И 0,64, СзН 05., М 170, ность определена на ультрацентрифу т. пл. 220 (с разл.) Ц 0,56, ге МОМ 3170 (Венгрия), скорость Су Н О М 154, т. пл. 200 С (с раэ 8000 об/мин 1 = 20 С, угол 30 ложением), Ц 072 (значения ве- время 30 мин 5= 1 7 10Оществ определены методом бумажной Е = 8,4 10хроматографии в системе Н-бутанол- Спектр ЯМР С снят на спектро-ная муравьиная кислота - вода метре Чатап ХЬв растворе 95:10:20). ВИБО й(11) внутренний стандартПолученные соединения по физико- ТМЗ, сигнал которого принят за 0 химическим константам спектральным 5 ( д -шкапа). данным (ИК-, УФ- и масс-спектры)и непосредственным сравнениям с исСтруктура общей формулы эпигалопытанными образцами идентифицировали хина подтверждена химическими превсоответственно с Флороглюцином, галло- ращениями и данными уф; щГи яира вой и протокатеховой кислотами. При С спектроскопии для полимера се1, действии соляной кислоты на раз- В УФ-спектре имеются максимумы56вдавленный водный раствор эпигалохина "ри 220 240 310 нм. В ИК-спектре образуются актоцианидины - цианидин- появляются полосы поглощения при и дельфинидин. 3200-3500 см (колебания гидроксильных групп), 1657 см "ООС-Арил)Выделение полимера с й=-1 из эпи1610, 1535, 1515, 1440 см (скелетгалохина. ные колебания ароматического ядра),30 г зпигалохина смешивают с 20 г 1535, 1515, 1150, 1040 и 830, 800,целлюлозы и помещают в,колонку с 770, 73 см(плоскостные и внеплос 1155601 10(С-О-М этерифицированной вторичнойОН-группы).В ЯМР" С-спектре полимера обнаружены резонансные сигналы; при 154- 10157 м.д. (С, С, Скольца Аэпикатехином), 145,9 м.д. (С-З иС) кольца В эпикатехинов, СиСкольца эпигаллокатехина); 133,9 м.д. (Скольца В эпигаллокатехина); 131,5 м.д. (Скольца Вэпикатехинов) при 119,5 м.д. (С кольца В эпикатехина) при 110,7 м.д(С, Сэпикатехина и С, С-бэпигаллокатехина), при 166,9; 145,9; 20121,9 и 110,7 м.д. (соответ, С-,С-З, и С, С; С; Си Состатка галловой кислоты), при107,7 м.д. (С-б, Си Сзамещенных колец А эпикатехияов)ф, 25105,4 м.д, (верхний конечныйС, примыкающий к замещенномуС), при 100,5; 96,5 и 98,5 м.д.(Сэпикатехинов), при 37,9,27,8 м.д. (соответ. Сзамещеняыхи Сконечного эпикатехинов).Распределение фракций с различ-ным молекулярным весом в эпигалохи" не установлено методом гель-фильтрации на сефадексе марки Ь Н,Фармакологическое исследование эпигалохина.Доза 100 мг/кг. Экспериментальнымя животными являлись белые беспород. ,ные мыши весом 18-22 г. Представленные данные получены на 800 животных;Гипоксическая нормобарическая45 гипоксия вызывалась помещеяием животных в герметически закрывающийся эксикатор. Препараты вводились внутрибрюшяняо за 30 мин до помещения в эксикатор. Полученные данные показаЖ ли высокую противогипоксическую активность эпигалохина на этой модели гипоксии.Статистическидостоверное удли. некие продолжительности жизни мышей начиналось уже с дозы 1 мг/кг, В дозе 10 мг/кг продолжительность жизни мышей, получивших эпигалохин, составила 1563 к контрольной группе, в дозе 20 мг/кг - 1653 и дозе 40 мг/кг2077 Противогипоксическая активность гутамина оказалась значительно слабее: в оптимальной дозе 100 мг/кгон удлинил жизнь животных на 1457.,т.е. меньше, чем эпигалохина в дозе 10 мг/кг, т.е. эпигалохин значительно активнее гутимина по защитномудействию при гипоксической нормобарической гипоксии.Гипоксическая гипобарическая гипоксия создавалась в барокамере. Животные "поднимались" до высоты 11 км со скоростью 1 км/мин. На "высоте" 11 км мыши наблюдались в течение 45 мин, Животные, преодолевшие этот временной барьер, считались выжившими. Препараты вводились за 30 мин до помещения мышей в барокамеру.Эпигалохин проявляют высокую противогипоксическую активность и на этой модели гипоксии. В дозе 20 мг/кг (внутрибрюшинно) он предохраняет гибели 603 животных (в контрольной группе все мыши погибли 3за 3, 2-0,58 мин) и статистически досто. верно удлинил продолжительностьжизни на 92,57 по отношению к контролю. Активность гутимина была меньшей: в дозе 100 мг/кг (внутрибрюшинно) он удлинил продолжительность жизни животных на 6503 и не предохранил от гибели ни одного животное.Таким образом, эпигалохин превосходит гутимин по защитному действиюот гипоксической гипоксии.Цитотоксическая гипоксия вызывалась подкожным введением цианистого натрия в дозе 8 мг/кг. Препараты вводились внутрибрюшиняо за 30 мин до инъекции цианистого натрия. Эпигалохин в дозе 40 мг/кг статистически достоверно удлинил продолжительность жизни животных в 5,74 раза. Действие гутимина быпо значительно слабее: в дозе 100 мг/кг ой удлинил продолжительность жизни лишь в 3 раза. Эпигалохин превосходит гутимия по.защитному действию от цитотоксическойгипоксии.Гемическая гипоксия вызываласьвнутрибрюшиниым введением нитританатрия в дозе 160 мг/кг. Препаратывводились на 30 мин до инъекциинитрита натрия, внутрибрюшинно.В контрольной группе погибли всеживотные. Эпигалохин в дозе 20 мг/кгпредохранил от гибели 17 мышей1155601 Составитель И. ДьяченкоРедакторТ. Веселова Техред С,Легеза корректор С. Юекмар Вае Еютиа иатвтэтвее еааепвееюв пеевоюЗаказ 3037/22 Тираж 384 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, 3-35; Раушская наб., д. 4/5 фипиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 и на 1573 удлинил продолжительность жизни остальных животных. Гутимин не только не проявил защитного эффекта, а статически достоверно уменьшил время их жизни в 2 раза по срав нению с контролем.Эпигалохин оказывает защитное действие от гемнческой гипоксии в отличие от гутнмина, ухудшающего ее течение. 10Изучение общего действия и токсичности эпигалохина показало, что при внутрибрюшинном введении вещество не вызывает изменений в поведе. нии животных до дозы 50 мг/кг, от 15 которой наступает небольшое уменьшение спонтанной двигательной актив ности и урежение дыхания. С увеличением дозы эти явления становятся более выраженными, животные группи руются, появляется птоз и расслабление шейных мышц. Спонтанные движения почти отсутствуют, однако на звуковое и болевое раздражение животные реагируют писком и реакцией и 1 бегания, ЛДр, рассчитанная по Ференсу, составляет 325 мг/кг. При введении внутрь действие препарата аналогично но начальная угнетающая доза составляет 200 мг/кг, а ЛД по Беренсу - 833 мг/кг, Следовательно, широта фармакологического действия эпигалохина при внутрибрюшинном введении в оптимальной дозе (20 мг/кг) составляет 16,2, ЛД,6 гутимина при подкожном введении составляет 1325 мг/кг, т.е. широта фармакологического действия для оптимальной дозы 100 мг/кг составляет 13,2.Таким образом эпигалохинпревосходит гутимин по широте фармакологического действия.