Способ получения инсулина

дИ Е А НЕТЕНИ воз Советских иалистиыеских Республик) 30.04 ааударотееииый ноет Саеета Миниотрое ССС иа делам изооретеиий и открытий(45) Дата оп Иностранец Ричард Ли Джексо72) Автор изобретения Иностранная фирма"Элтт Лилли энд Компани (США) 71) Заявител 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ЛИ рмацевтичес цинковая соль инсулина - протамин путемприбавления к раствору кристаллическогоинсулина цинка хлоридв,и протамин-сульфаЮта,Для поъышения быстроты и длительностидействия веществе смешивают натриевуюсоль инсулина в соотношении нв каждые100 ед. инсулина 0,2 - 1,5 мг протвминаи растворяют в воде при рН 6,5-8,0,Соль инсулине приготавливают путем щелочной кристаллизации инсулина, применяяедкий нато, гидроокнсь щелочного металлаили гидроокись аммония, После кристаллизации кристаллы промывают и сушат до техпор, пока ссдержание влаги будет менее10%. Соль инсулина мгновенно растворяеч-.ся в воде при нейтральном рН и может храниться в растворе до 3есяцев без существенного ухудшения,соединяют взовался комн- рН водной а и протамин ак, чтобы обре лина-протвмин нсулин т водной лекс с н Изобретение относится к факой цромышленности. Известен способ получения комплекс среды 6,5-8,0. Комплекс соль инсулина-протамин может быть легко отделен от жидкой среды фильтрованием и высушен. Комплекс в сухой форме может храниться год иболее. Если применяют коиплекс соль инсулина-протамин, то его:растворяют в водной среде, предпочтительно в изотоническомразбавителе при рН 6,5-8,0. После растворения комплекс готов для инъекции Комп 1 О лекс характеризуется быстро наступающими длительно продолжающимся действием,Изготовление комплекса соль инсулина-протамин состоит в приготовлении натриевой соли инсулина, почти не содержащей 1 а цинка, т.е, менее 0,05% (нвтриеввя соль вкристаллическом виде, но растворима в воде или в изотоническом разбавителе). Затемнатриевую соль растворяют в жидкой средев аком количестве, чтобы на 100 млжид кой среды приходилось 90-115 ед, Затемк жидкой среде добавляют требуемое количество протвмин-сульфата. Образуется нерастворимый комплекс в виде очень тонкого оседка. Тонко распределенный осадок 25 хорошо суспендируется в жидкой среде, такчто иньекпия производится легко. Если комплекс хранится в жидкой среде, то оа остается стабильным и не теряет,активиобть в течение года.Натриевую соль инсулина получака пуем обработки неочищенного инсулина едким натрем и водном растворе, причем едкий . натр присутсгвует в количестве, необходи- мом для получения рН 8-8,5. Натриевая соль инсулина осаждается в растворе и легко отделяется деквнтированием, центрифугироввнием фильтрованием, Натриеваг сцль может быть очищена последующим . растворением и нерекрясталлизацией. Анализ показывает, что пре примененяи нвт риевой соли инсулина на 1 моль натрия присутствует 1 моль инсулина. Кристаллы натриевого инсулина могут содержать обычный или свиной инсулин и легко растворимы в воде:и изотонических растворах при рН около 7.Протамин обычно присутствует в виде протвмин-сульфата или в другой водорастворимой форме.Если применяют изотонический оаэбвви тель в качестве среды для протвмин-суль-фата и соли инсулина, необходимо чтобы рвзбввитель содержал консервирующее средство. Консервирующим средством являетсяфенол и метилп -гидрооксибензоат. фБиологическую активность комплексаопротамин-инсулин определяют на кроликах.36 кроликов (2 равные группы) выдер живают голоднымн 24 часа перед испытевием, В течение всего испытания им не деют нн воды, нипищи. Для определенияпервоначального содержания сахара в кровипробу крови берут яз концевой ушной вены,Контрольной группе кроликов впрыскивакеназначенную дозу нейтрального нротамининсулина Хагедорн ( ЯРН), испытываемойгруппе ииьецируют комплекс протвмии нач- риевый инсулин (Р 3:) ), Первую пробу крови у каждого кролика берут через ЗО мин.Последующие пробы берут через 1,5, 3,5, 7 и 9 час после инъекции, Каждую пробу анализируют на содержание сахара в крови, результаты выражают в миллиграмм//процентах глюкозы; Для обеих групп вычиочя ляютсреднее содержание сахара для каждого отбора проб.Если применяют перекрестное испытание,кроликов., которые получают контрольнуюпробу, иньецируют комплексом протамин натриевый инсулйн ,й наоборот. Эти яспытьнич проводят через неделю по окончаниипервоначальных испытаний.Полученные результатывыраженные каксреднее содержание сахара в крови в мил- ЗО лиграммпроцентвх, представлены втвбл.1.Таблицв 1минплекс про ует более К дукт во, чем 3 (прот ют со нсулин)Комплекс Р 5 сулин) срввнивв ный обычный и триевый инсулин более продолжиамин-,натриевый ин месью АЙ 3 (кислоьн ЯРН и" соотноше- Ю.75%И вп кав в инсулина. нывт Результаты аблица емя,держани-.вует быстро, хотя действия не такаяинсулиновых продуь- й продукты действуЭъ товой и часчий натриевый едующим образо ют из бычьей п исленной водно иль вают сл сгрвгиру зы, полк т, сосг Злю 60 кислотИнсулин элудочной жел и р Проводят сравнение трех. типов иейтральщах продуктов протамин-натрненый инсулин В комбинации с 0,02 мг цинкаща 100 ед, инсулина. Каждый инсулиновый продукт содержит 0,02 мг цинка на 100 ед, инсулина,При добавлении цинка определяют его влияние на быстро наступающее и долго продолжающееся действие комплекса прота .мин натриевый инсулин, Неблагоприятного Свиной инсулин цейс продолжительность его длительная, как других тов. Бычий и смешаннь ют быстро и д Примеса протамин-и К ристалличлин приготавли я не наблюдавниваюг три улины, а т чьего и 25 ытание прово ается, продукта: свиной и бьакже смесь, содержащую % свиного инсулина. дят над 6 кроликами, ют 0,01 мл, т,е, дозу ара в крови (мг/%)после введе средой; концентрируют под вакуумомично очищают дробным осаждением;,стым натрием и изоэлектрическимнием. Затем инсулин очищают щелочисталлизацией при рН 8, Полученныелы растворяют в разбавленной уксуслоте (0,5 н) и далее фракционируютванием на С:фадексе Г,вший из 0,5 и.уксуснойна, нейтрализуют 1 н, ед508167ким нвтром и перемешивают 1 час при ком ватной температуре. Затем кристаллы нетря евого инсулина отделяют фильтрованием и промывают 2%-ным хлористым натрием, После чего промытые кристаллы вносят и избыток,абсолютногоспирта при сильнОм перемешивании, отфильтровывают и собирают. После второй промывки абсолютным спиртом кристаллы прожыввют эфиром и высушивают в вакууме, Ю П р и м е р 2. Нейтральный комплекс ф приготавливают,аналогично примеру 1,. звисключением того, что нзотонический разбавитель содержит 1,2 мг протвминв/мл. Каждое испытание проводят нвд Э кроликами.Между испытаниями комплекс, суспендированный в нзотоническом рвзбввнтеле хранится при 25 оС, Кроликам впрыскивают по 0,01 мл ннсулинового продукта,Результаты приведены в табл 4,Получают кристаллический бычий натриевыйинсулий со следующей характеристикой:активность -25,8 ед,/мг азот - 15,82%;влага .8,0%;, цветной , индекс. - О, 005 для 1151%-ного раствора при 340 ммкм,Порцию сухого нвтриевого инсулина вколичестве 8,98 г растворяют в 990 млсвободно от пирогена воды содержащей2,27 г фенола и 1,5 мл 1 ОЪ-ной НС 6,Затем с помощью 1,7 мл 10%-ногоЯвОНдоводят до 7,4. Испытания показали, чтоактивность инсулина 101,3 ед./мл. Этотраствор подвергают стерильной фильтрвдии35и разливают в флаконы по 1 мл, высушивамют при температуре ниже ОоС в всептичеоких условиях и получают в каждом флаконесухой. натриевый инсулин, который и сохрв-няется в таком виде до испытаний,28В каждый флакон добавляют иэотоничеокий раэоавитель в таком количестве, чтобы жидкая среда содержала 101,3 ед, инсулина /мл. Этот изотонический раэбавитель.содержит 0,4 мг протамин-сульфата// /мл, 1,6% глицерчча и 0,25 вес,% фенола, рН иэотонического .вствора 7;4. После добавления иэотонического раствора к сухому нвтриевому инсулину происходит мгно- венное образование комплекса протамин-наъриевый инсулин. Эт зт комплекс находится в флаконе в виде тонко распределенного осадка. Осадок остается достаточно равномерно суспендированным в водном разбавителе, так что при взятии",инъекционным шприцем каждый раз отбирают одинаковое количество инсулина.Данные таблицы поквзыввют, что даже после, хранения комплекса, суспендироввнного в изотоническом рвзбввителе, при 25 С сохраняется активность инсулина; онодействует быстро и длительно.П р и м е р 3. Образование и применение комплекса протвмннв с вммонийным, литиевым и калиевым инсулином, в также нвтриевым инсулином примерв 1. Квждую из эти;: инсулиновых солей получают но методике примера 1, смешивают с иэотоническим раствором, содержашим 0,4 мг протвм н-сульфата/мл, и впрыскивают так, квк описано в примере 1, 18 кроликам,Результаты приведены а табл, 5,.Таблица 5 Натриевый инсулин действует длительно,.другие же составы вызывают значительное Оснижение содержания сахара в крови,Таблица 6 Времчас,5 Формула лэ Способ получения прпутем смешивания соли 60 мин-сульфатом, о т л и е я парата инсулинансулина с протча юши йс П р н м е.р 4. Стабильность комплексапротамин-натриевый инсулин,Комплекс приготавливают аналоАчно примеру Х, применяя О,4 мг/мл протамин-суль фата в изотоническом раэбавителе. После приготовления комплекс помещают в проби ки центрифуги, центрифугируют и выделившуюся жидкость декантируют, Отделенный осадок промывают 15 мл абсолютного спирта и затем 15 мл абсолютного эфира. Проаждый из высушенных инсулиновых со растворяют и инъецируют, что вызызначительное снижение содержания сав крови,мытый осадок затем высушивают в вакуумепри комнатной температуре.Высушенный материал снова суспендйру-ьют в нейтральном раэбавителе, не содержащем протамин-сульфата, Суспендйрованныйматериал анализируют на активность. Активность 88-95 ед./мл, что показывает легкуюпотерю инсулина при промывке перед сушкой,Испытания проводят на 9 кроликах.Данные приведены в табл. 6, Испытанияс высушенным при низкой температуре материалом проводят с материалом, сновасуспеидированным в воде и затем высушенным при низкой температуре,508162 Составитель П. МалютинаРедактор Т. Загребельная Техред О. Луговаа Корректор А Ьсева Заказ Щб Тнраж бДЯПодписное ОНИИПИ Государственного комитета Совета Миннстров СССР по делам, наобретеннй неоирытий 113035, Москва, Ж, Раушская набд,4/5филнал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Гагарнна, 101 тем,.чтс с целью повышения быстроты ндлительности действия вещества, смешиваювнатриевую соль ннсулнна в соотношении на 12каждые ДОО ед. инсулина 0,2-1,5 мг протамнна и растворяют в воде при рН 6,5- 8,0.