Способ получения химопапаина

, 1838407 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДО МСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ПАТ ие способ и целевог 1. (71) Жиноин Дьедьсер еш Ведьесети Термекек Дьяра РТ(НО)(56) к.апдеп Е,Р., Ваиз А.К,3.Во, Сдев. 137459 - 460, 1941.ЕР М 0065395, кл. С 12 й 9/50,опубл. 1982,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМОПАПАИНА Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения химопапаина высокой чистоты с высокой специфической активностью из сырого химопапаина посредством гель-хроматогра- фии Цель изобретения - ускорени увеличение удельной активностпродукта.Сущность изобретения зактом, что сырой химопапаин в пвосстановителя растворяют в воферном растворе, прозрачнуюную жидкость раствора погель-хроматографии, и содержаный фермент фракции собираютгают сушке вымораживаниехимопапаин обычно растворяютном или ацетатном буферномвеличиной рН 5-7, который содчестве восстановителя цистеин,танол или сульфит натрия, Вхроматографической колонки обдит применение колонка из Сефа лючается в рисутствии де или в бу- надосадочдвергают щие активи подверм. Сырой в фосфатрастворе с ержит в ка- меркаптоэкачествеычно находекса 6-50(57)Использование: биотехнология, может найти применение в клинической практике. Сущность изобретения: сырой химопапаин в присутствии восстановителя растворяют в буферном растворе - фосфатном или ацетатном с р Н между 5 - 7. Прозрачную надосадочную жидкость подвергают хроматографической очистке методом гель- фильтрации на сефадексе 6-25 или сефадексе 0-50, содержащие фермент активные фракции собирают и сушат вымораживанием, Получают химопапаин в удельной активностью 51 - 70 Е,или Сефадекса 6-25, которую предварительно уравновешивают при помощи буферного раствора или солевого раствора, преимущественно при помощи содержащего цистеин фосфатного буферного раствора, В интересах эффективной хроматографии колонку выбираюттакимобразом, чтобы длина относилась к диаметру как 5 - 50:1, предпочти- фь тельно как 20:1. ООЗамораживание проводят при -20 до - Ф 70 С, предпочтительно при -40 С, лед уда- О ляют в вакууме и ри давлении между 1,333 Рв и 13,33 Ра, предпочтительно 6,666 Ра, известным образом,Дающее с хлористым барием осадок, неприятно пахнущее вещество находится в хроматографическом пике, который следует за активным ферментом.Способ по изобретению имеет следующее и реимущество.Удаление ответственной за вредные побочные действия, дающей с хлористым барием осадок белковой компоненты путем гель-хроматографии дешевле, мягче и в де 1838407сять раз быстрее, чем известные способы.Поэтому способ по изобретению также значительно пригоднее для осуществления вкрупном промышленном масштабе, чемионообменная хроматография, которая продолжается около,40 ч, За это продолжительное время фермент неизбежноповреждается, Гель-хроматография, напротив, может осуществляться в течение 4 часов и дает возможностьзащищать ферментхимическим путем - физиологически безвредными, ионными восстановителями. Таккак гель-хроматография имеет более высокую степень разделения, полученный продукт гораздо чище, что - как и следуетожидать - приводит к существенному ослаблению побочных. действий,Способ поясняется чертежом,П р и м е р 1, 2,5 г сырого химопапаинарастворяют в 135 мл содержащего 10 мМцистеинфосфатного буферного раствора (3мМ.рН 6,5), Если раствор мутный, то егофильтруют. Через 10-30 мин хроматографируют 135 мл раствора на колонке с Сефадексом 6-25 (4 х 100 см) с буферным раствором,который содержит 3 ммол фосфата и 1 ммолцистеина и имеет величину рН 6,5,Первый пик (обозначенный на фиг, 2при помощи А) содержит химопапаин, около1,3 г. Пик В содержит образующее с хлористым барием осадок, неприятно пахнущее,неактивное вещество,Находящийся в пике А фермент фильтруют а стерильных условиях и подвергаютлиофилизации.Активность химоп."паина в любом случае определяли при насыщении субстратом(сложном бензилоксикарбонилглицин-рнитрофениловом эфире (ЮЙ) в следующейреакционной смеси:100 рл приготовленного с ацетонитрилом 20 й-раствора с концентрацией 1л 1 гl мл,2,8 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора с величиной рН 5,5 который содержит1 мМ ЕОТа,100 Йл химопапаина.Для характеристики препаратов указывают ниже измеряемое при 25 ОС в течение1 мин при длине волны 340 нм изменениеоптической плотности (экстинкции). которую вызывает 1 мг химопапаина на 1 млреакционной смеси (Е).Полученный фермент имеет активность62 Е.П р и м е р 2. Работают по описанномув примере 1 методу, но колонка имеет больший диаметр (5 х 100 см). Удельная активность 70 Е,П р и м е р 3, Работают по описанномув примере 1 методу, но применяют короткуюколонку (10 х 16 см). Здесь не происходитникакого отделения образующего с хлори 5 стым барием осадок вещества от химопапаина. Удельная активность 42 Е,П р и м е р 4. Работают по описаннол 1 ув примере 1 методу, но примененный дляхроматографии буферный раствор не содер 10 жит цистеина, удельная активность 51 Е.П р и м е р 5. Работают по описанномув примере 1 методу, но приготовляют болееконцентрированный раствор из химопапаина (содержание белка 5, - вес/объем.).15 Удельная активность 55 Е,П р и. м е р 6, Работают по описанномув примере 1 методу, но выделение производят не при комнатной температуре, а при2 - 10 С. Удельная активность 65 Е.20 П р и м е р 7, Работают по описанномув примере 1 методу, но вместо Сефадекса6-25 применяют Сефадекс 6-50. Удельнаяактивность 53 Е.П р и м е р 8, Работают по описанному25 в примере 1 методу, но концентрация фосфатного буферного раствора составляет не3 мМ, а 10 мМ. Удельная активность 63 Е.П р и м е р 9. Работают по описанномув примере 1 методу, но вместо фосфатного30 буферного раствора с рН 6,5 применяютацетатный буферный раствор с величинойрН 5,5; Удельная активность 67 Е;П р и м е р 10. Работают по описанномув примере 1 методу, но буферный раствор35 содержит не 1 мМ цистеина, а 5 мМ цистеина, Удельная активность 64 Е,:П р и м е р 11. Работают по описанномув примере 1 методу, но к содержащей активное вещество фракции (пик А) в пересчете40 на имеющийся белок, добавляют 10 вес.цистеина. Удельная активность 63 Е,П р и м е р 12, Работают по описанномув примере 1 методу, но в качестве восстановителя вместо цистеина применяют сульфит45 натрия. Удельная активность 60 Е,П р и м е р 13. Работают по описанномув примере 1 методу, но из всех трех хроматографических пиков отбирают пробу по 1мл объемом и к каждой пробе добавляют 0,250 мл н соляной кислоты и 0,2 мл 12 -ногораствора хлористого бария. Осадок образуется только во фракции В,П р и м е р 14, Активнос 1 ь примененногов качестве эталона препарата химодиактив 55 на В (Япзй 1 аЬога 1 опез пв,. США) измеряют укаэанным в примере 1 методом. Онасоставляет 28 Е.Таким образом, использованы": предложенного способа позволяет Г.ыс 1 ро отделить с помощью гель фильтрации1838407 10 Составитель Р, СмирноваРедактор В. Трубченко Техред М, Моргентал Корр Ваш кович Заказ 2905 ВНИИПИ Тираж Подписноеарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 оизводствецно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ингибирующий компонент (в 10 раз быстрее, чем с помощью ионообменной хроматографии) и получить препарат с более высокой активностью, чем известные(51-70 . Е вместо 28). 5Формула изобретенияСпособ получения химопа паина, предусматривающий растворение неочищенного папаина в буфере. хроматографическую очистку в присутствии восстанОвителя ЯН-группы и лиофильную сушку, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа и увеличения удельной активности целевого продукта, растворяют химопапаин в фосфатном или ацетатном буфере с рН 5 - 7, а хроматографическую очистку проводят методом гель-фильтрации на сефадексе 0-25 или сефадексе 0-50,