Способ дифференциации энтеровирусов

-исследовательский ской и клинической Вуткаревприменению нифанантификации энтероои . Коксаки В и ЕНСО ЕРЕНЦИАЦИИ ЭНТЕИзобретение относится к медицинской вирусологии и лижет быть использовано для дифференциации энтерооирусао; полиомиелита, Коксаки А, Коксаки В и ЕСНО.Целью изобретения является пооышение точности дифференциации энтерооирусао,Для реализации этой цели используют гидрохлорид гуанидина, способного подавлять репродукцию пикорнооирусоо, в т.ч. и вирусов группы Коксэки А. Отсутствие репродукции цитопатогенных изолятоо о культуре клеток, поддерживающая среда которых содержит гидрохлорид гаунидина в концентрации 200 мкгlмл и наличие одновременно в культуре клеток, поддерживающая среда которых содержит рабочую концентрацию нифана белфтазида и ихсмеси 10 мкг/мл (при учете контрольных проб), позволяет отнести исследуемый изолят к вирусам Коксэки А,Способ иллюстрирует следующий пример: прооадили дифференциацию 36 изолятов, выделенных ат больных нгитом, герции, а также среды (сточмав), ой культуры ГОСУДАРСТВЕНбОЕ ПАТЕВЕДОМСТВО СССР(71) Молдавский научинститут профилактмедицины(56) Инструкция побелфтазида для идерусов полиомиелитаУтв. 18.11.86.(57) Использование: вирусология, медицина, Сущность изобретения: к культуре клеток амниана человека добавляют отдельно нифэн, белфтэзид. их смесь и гуанидин гидрохлорид, Затем добавляют исследуемый материал, После инкубации определяют цитопатическое действие, Балфтэзид устанавливает наличие вирусов Коксаки В и ЕСНО, нифап-вирусы полиомиелита, смесь нифана и белфтазила и отдельно гуанидин гидрохлорид - вирусы Коксаки А, 2 табл. полиомиелитом, серазным л 1 е ипан гиной отдельно н о ассоциаиз образцов проб окружающейные соды, вола открытых оадаеПриготовление переонваемомниона человека Е .Отбирают культуру со сплошным мона- слоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко выраженныл 1 и границалби между клетками. Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-лерсеном. Для этого приготавливают смесь равных объемов 0,250 раствора трипсина и растоора оерсена, подогревают ее о водяной бане до 30 - 35 С. Вначале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промыоэ,от 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем теплой смесью (трипсин-версен) заливают моно- слой культуры клеток так, чтс бы осе участки были покрыты жидкостью, В матрасы обьемам 100, 250 и 1000 мл раствор добавляют, 1824441соответственно, по 10, 15 и 30 мл, Матрасы вгтряхивают и помещают в тйрмостат (37,0 С) на 1520 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла, Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин. при 2000 об/мин., смесь трипсин-вервен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клегок подсчитывают в счетной камере Го- ряева. Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 60 тыс. клеток, В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла; среду 199, Игла-МЕМ, 0,5 Д гидролизат лактальбумина и дрс добавлением телячьей сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота (10;ь-ной) и антибиотиков. Перевиваемые клетки (Р) разливают в пробирки по 1,0 мл, Для поддеркивания роста клеток используют те же вышеприведенные питательные среды беэ добавления сыворотки. В ппобирках среду меняют через 4-ро суток культивирования клеток, Обновление спло,иного монослоя клеток новой генерации наблюдали через 5-6 суток,Приготовление рабочей концентрации растворов ниофана, белфтазида и их рабочей смеси,Обьемы рабочих растворов готовят в зависимости от количества типируемых изолятов. Препараты при разведении трижды перемешивают пипеткой, объемом 10,0 мл. Исходные растворы из вскрытых ампул хранятся в стеклянных емкостях с притертыми пробками прп 4.+2 С до 60 суток, а рабочие растворы не хранятся,Для приготовления рабочего раствора нифана. используемого в опыте, во флакон с 49,9 +0,1 мл поддерживающей среды добавляют 0,1+0,01 мл содержимого ампулы, Аналогичным образом готовят рабочий раствор белфтазида. Это пример приготовления 50,0 мл рабочего раствора с концентрацией 10,0 мкг/мл, Смесь соединений получают путем объединения равных обьемов нифана и белфтазида в рабочих концентрациях 20 мкг/мл,Приготовление рабочей концентрации гидрохлорида-гуанидина.Объем рабочего раствора готовят в зависимости от количества типируемых изолятов. Отвешивают 20,0 мг гидрохлорида гуанидина, высыпают а стерильный флакон и добавляют поддерживающую среду да 100,0 мл. Раствор стерилизук 1 т через асбестовый фильтр. Это пример приготовления 100,0 мл рабочего раствора гидрохлорид-гуанидина с концентрацией 200,0 мкг/мл.Титрование вируссодержащего материала.Титрование изолятов, подлежащих дифференциации, проводят в культуре клетокР методом конечного разведения по цито"0 патогенному действию и выражали в 1 цЦПДщ. Для титрования изолятов вначалеготовят различные их развед 8 ения, обычнодесятикратные от 10 до 10 . Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физио 15 логического раствора или раствора Хэнкса.Затем в первую пробирку вносят 1,0 мл вируссодержаиего материала и получают разведение 10 (1:10). При помощи новойпипетки содержимое первой пробирки тща 20 тельно перемешивают и 1,0 мл переносят во 2вторую пробирку, получая разведение 10(1:100) и т,д. Перед заражением монослоякультуру Р иэолятами, предварительнопроизводят 3 раза отмывание культур кле 25 ток от сыворотки раствором Хэнкса, рН 7,5или раствором Эрла, рН 7,6, На каждое десятикратное разведение вируссодержащегоматериала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал30 вносят на монослой клеток в объеме 0,1мл, а затем клетки инкубировали при 37,0 .+О,1 С в течение 60 минут, после чего вносят поддерживающую среду беэ сыворотки.Инкубирование зараженной культуры про 35 изводят при 37,0+0.1 С. Состояние эаракенной культуры периодически проверяютпод микроскопом в течение 7 дней, Результат цитопатического действия ЦПД 5 о изолята считают положительным, если не менее40 половины клеток в культуре подвергалисьспецифической дегенерации. Титр (50,0эффективной дозы) вычисляют по методуРида-Менуа.Дифференциацию вирусов проводят по45 следующей схеме; в пробирку с культуройклеток, освобожденных от ростовой среды,заливают по 1 мл поддерживающей среды,содержащей отдельно нифан, белфтазид иих смеси и гидрохлорид гуанидина в рабочей концентрации (по 4 пробирки), Затемвносят в каждую пробирку исследуемый материал в объеме 0,1 мл с активностью 100ЦПД 5 о.В опыте ставят следующие контрольные55 пробы,1, Неинфицированную культуру клеток сраствором нифана.2. Неинфицированную культуру клеток сраствором белфтвзидв.со смесью растворов нифана и белфтазида, 4. Неинфицированную культуру клеток10 15 20 микроскопом. Результаты учитывают при 3, Неинфицированную культуру клеток с раствором гидрохлорида гуанидина. 5. Неинфицированную культуру клеток с поддерживающей средой,6. Культуру клеток, инфицированную исследуемым материалом в обьеме 0.1 мл, активностью 100 ЦПД 5 о с поддерживающей, средой.Для каждой контрольной пробы используют по 2 пробирки с культурой клеток,Учет результатов,Определяют степень защиты культурыклеток нифаном, белфтазидом и гидрохлоридом гуанидина от цитопатического действия (ЦПД) исследуемого материала по сравнению с таковым в контрольных пробах, в присутствии поддерживающей среды без нифана, белфтаэида и гидрохлорид-гуанидина. Просмотры культуры клсток проводят через 24, 48 и 72 часа под световым регистрации в контрольной пробе исследуемого материала ЦПД на 3-4 креста. В не- инфицированных контрольных пробах клеток ЦПД должно отсутствовать, При наличии токсических изменений в культуре клеток в вышеперечисленных контрольных пробах со стороны нифана, белфтазида и их смеси результаты не учитывают и опыт повторяют с дозой, равной 1/2 либо 1/4 рабочей концентрации. При наличии подобных изменений со стороны гидрохлорида гуанидина вместо 200,0 мкг/мл используют рабочую дозу 150,0 мкг/мл, Белфтазид устанавливает принадлежность идентифицируемых агентов к группе вирусов Коксаки В и ЕСНО, нифан - к вирусу полиомиелита, смесь нифана и белфтазида - к вирусам полиомиелита ЕСНО и Коксаки В, а смесь нифана с белфтазидом и отдельно гидрохлорид гуанидин - к группе вирусов Коксаки А (табл.),В результате дифференциации 32 изолятов от больных знтеровирусными инфекциями, а также из образцов окружающей среды установлено следующее: 8 относились к вирусу полиомиелита, 18 - к группам вируса Коксаки В и ЕСНО. 2 - к вирусам полиомиелита, Коксаки В и ЕСНО, остальные 4 изолята относились к группе вирусов Коксаки А. 25 30 35 40 45 50 При сопоставлении результатов дифференциации энтеровирусов с аналогичными. полученные в результате использования общеизвестных приемов идентификации(в реакции нейтрализации и встречного иммуноэлектрофореэа с типоспецифическими иммунными сыворотками к энтеровирусам, производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов), отмечалось полное совпадение.Так, иэ 8 изолятов вируса полиомиелита два штамма относились к типу 1, остальные 2 и 4 к типам И и И 1, Из 18 изолятов, принадлежащих к вирусам Коксаки В и ЕСНО: 4 штамма относились к вирусу Коксаки 01, 3 - Коксаки ВЗ, 2 - Коксаки В 6, 6 - к вирусу ЕСНО 6, остальные 3 штамма - к вирусу ЕСНО 7. Из 2 изолятов вирусов, принадлежащих к группе вирусов полиомиелита, Коксаки В и ЕСНО, были идентифицированы два штамма вируса г 1 олиомиелита типов И и И 1, по одному штамму Коксаки ВЗ и ЕСНО 6. Остальные 4 иэолятв, относящихся к вирусам Коксаки А,были идентифицированы как Коксаки А 7 (два штамма), Коксаки А 9(один штамм) и Коксаки А 11 (один штамм).Таким образом, осуществление дифференциации энтеровирусов по предлагаемому способу является приемлемым для любой вирусологической лаборатории ввиду несложности технологических приемов, не связано с дополнительныли экономическими затратами и обладаег повышенной точностью, так как помимо известных групп энтеровирусов позволяет выявить дополнительную группу вирусов - Коксаки А. Формула изобретения Способ дифференциации энтеровирусов, включающий заражение культуры клеток амниона человека, добавление в пробы нифана, белфтаэида или их смеси с последующей дифференциацией вирусов полиомилеига, Коксаки В и ЕСНО по цитопатическому действию, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что. с целью расширения функциональных возможностей способа путем выявления вируса Коксаки А, параллельно в дополнительную пробу добавляют гидрохлорид.гуанидин и дифференцируют вирус Коксаки Л от других вирусов по отсутствию цитопатического действия.1824441 Таблица 1 Ин и и ованные клетки Неин и и ованные клетки Прибелф- гуанитаэид дин белф- гуанитаэид дин нифан нифан среда смесь нифанаи белф- таэида смесь нифанаи белф- таэида среда.Культура иле 2. Тожес Варианты, воэможные при учете реэультатов опыта П р и м е ч а н и е: - отсутствие дегенерации клеток;+ дегенерация клеток на 3-4 креста,Таблица 2Характеристика способа-прототипа и предлагаемого способаидентификации антеровирусов полиомиелитЕСНО,Коксаки ВполиомиелитЕСНО,Коксаки ВКоксакиАне антеровирус,либосмесьвиру- сов1824441 Продолжение табл,2 З.Диагностические препараты. нифвв, белфтаэид 3. Диагностические препараты: нифан, белфтаэид, гццрохлорид гуанидина 4.Световой микроскоп 4. То же самое Биологические свойстваВ1.Нифан - подавляет репродук. То же свмоецию вируса полиомиелита 2.Белфтазид - подавляет репро. То же самое зУЕЮа вирусов Коксаки В и ЕСТ З.Смесь нифана и белфтаэида 3. То жв самоеподавляет репродукци вирусов полиомиелита, Коксаки Ви ЕСНО 4.Нифан и белфтазид (их смесь) 4.Гидрохлорид гуанидина подавляет не подавляют репро репродукцию оикорновирудор, в вирусов Коксаки А тою, вирусов Коксаки А (4) Назначение Диф 4 еренциальная диагностика вирусов полиомиелита, Коксаки А и В, попелепах ие проб от болейпх и здоровых людей (фекалий, носоглоточцые смывы кровь, спкнио-мозговая мщкость), объекты окружающей среды (сточные воду, вода открытых водоемов и т.пе) Дифференциальная диагностика вирусов полиомиелита, Коксаки В и ЕСНО, щщеленных из пробт больных и здоровых людей фекалии, носоглоточные смывы, кровь сйинно-мозговая жидкость обьекты окружающей среды (сточные роды, вода открытых водоемов) и т,п. Способ примененияТехнология осуществления спо- Технология предлагаемого способа соба, учет результатов деталь- предусматриввет,помимо известных но описаны в прилагаемой ин- инградиентов, дополнительный -приструкции (1) готовление рабочего раствора гидрохлорида гуыощинаСтоимость препаратовКооператив "Диагиостикум" при То же самоеЛьвовском НИЛ гематологии ипереливания крови реалиэуетпрепараты по цене:(месь "гЬэрана" и Ъелфтаэида"- Всегое 4 0 + ОрО 0021 коп 4,0 руб. - 2,0 руб, - 0,00021 коп. (практически не отличается от прототипа) Всего: 4,0 руб,1824441 Продолжение табл.2 2 Точность дифференциации Способ-прототип устанавливаетпринщлежность энтвровирусовк следующим группам.1. Полиомиелит 1. Полиомиелит 2. ЕСНО, Консаки В 2. Е(НО, Коксаки ВВ 3. Полиомиелит, ЕСНО, Коксаки В 4. Коксаки А 3. Полиомиелит, ЕСНО, Коксаки4. Не энтеровирус либо смесьвирусов б. Не энтеровирус либо смесь вирусов Дифференциация по упрощенной схемеЕсли аресто смеси "Нифвн" + "Белфтаэид" использовать гидрохлоридгуоиидина, то вфференциацив антеровищгсов моано проиавести иа уровне следуиирщ групп 1 см.табл.):1. Полиомиелит Не военнно 2, БНО, Коксаки В3. Полиомиелит, Е(НО, Коксаки А и В4. Нв энтеровирус, либо смесь вирусСледовательно, смесь "Нифанф 4- "Белфтазщ" можыо еаменить растворомгидрохлорида гуанидина. В этом случае стоимость препаратов составляет2 руб.; 0,0002 Гвместо 4,0 руб. Составитель К,Спыну Техред М.Моргентал Корректор В.Петраш Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 2216 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж, Раушская наб 4/5